Preparación del nervio ciático de rata para neurofisiología ex vivo

La comprensión actual de la función nerviosa fundamental según lo modelado in silico carece de varios aspectos, especialmente con respecto a los efectos de la compartimentación del tejido nervioso fuera del soma, el axón y las dendritas. Las interacciones axon-mielina todavía son poco conocidas, como lo demuestra el hecho de que incluso los modelos nerviosos computacionales detallados como MRG¹ (para nervios de mamíferos) que capturan adecuadamente la respuesta de estimulación eléctrica convencional, no capturan otros comportamientos observados experimentalmente, como el arrastre de bloque de alta frecuencia² o la respuesta de inicio secundario³.

Este protocolo proporciona un método para investigar eficientemente los procesos neurofisiológicos a nivel nervioso en un modelo animal de laboratorio pequeño agudo, utilizando un protocolo de preparación estandarizado para aislar el nervio, controlar su entorno y eliminarlo de un contexto in vivo a un contexto ex vivo. Esto evitará otros procesos corporales o anestésicos utilizados por los protocolos de estimulación nerviosa in vivo para alterar el comportamiento nervioso y confundir los resultados medidos o su interpretación ^4,5. Esto permite el desarrollo de modelos más realistas que se centran únicamente en los efectos específicos de los tejidos nerviosos que son poco conocidos. Este protocolo también es útil como banco de pruebas para la nueva estimulación nerviosa y el registro de materiales y geometrías de electrodos, así como nuevos paradigmas de estimulación como el bloque de alta frecuencia ^2,3. Las variaciones de esta técnica se han utilizado previamente para estudiar la fisiología nerviosa en condiciones estrictamente controladas⁶, por ejemplo, para medir la dinámica y las propiedades de los canales iónicos o los efectos de los anestésicos locales⁷.

Esta técnica aporta varias ventajas frente a alternativas como la experimentación aguda in vivo con pequeños animales⁸. La técnica evita la necesidad de mantener la profundidad de la anestesia a medida que el tejido se ha extraído del cuerpo, reduciendo la cantidad de equipo requerido, como un difusor anestésico, un concentrador de oxígeno y una almohadilla térmica. Esto simplifica el protocolo experimental, reduciendo el riesgo de errores. Como los anestésicos pueden alterar potencialmente la función nerviosa⁴, esta técnica garantiza que las medidas no se vean confundidas por los efectos secundarios de estos compuestos anestésicos. Finalmente, esta técnica es más apropiada que los experimentos agudos in vivo a la hora de estudiar los efectos de compuestos neurotóxicos como la tetrodotoxina, que mataría a un animal anestesiado por parálisis.

Las secciones nerviosas periféricas son un sistema ex vivo único, ya que existe una alta probabilidad de que las fibras responsables de las señales neuronales registradas no contengan ningún soma. Como estos normalmente se ubicarían, para las neuronas motoras, en la columna vertebral y para las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal junto a la columna vertebral, la preparación de una sección del nervio de los mamíferos se puede modelar aproximadamente como una colección de membranas tubulares con canales iónicos, abiertos en ambos extremos⁹. El metabolismo es mantenido por las mitocondrias localizadas en el axón en el momento de la disección tisular¹⁰. Se recomienda la sutura de los extremos abiertos del axolemma después de la extracción para cerrarlos y, por lo tanto, ayudar a mantener los gradientes iónicos existentes a través de la membrana, que son esenciales para la función nerviosa normal.

Para mantener la homeostasis tisular fuera del cuerpo, varias variables ambientales deben ser estrictamente controladas. Estos son la temperatura¹¹, la oxigenación¹², la osmolaridad, el pH^13,14 y el acceso a la glucosa para mantener el metabolismo. Para este protocolo, el enfoque es utilizar un tampón Krebs-Henseleit^{modificado 15,16} (mKHB) continuamente aireado con una mezcla de oxígeno y dióxido de carbono. El mKHB pertenece a la familia de tampones cardiopléjicos ^6,17 utilizados para preservar tejidos disecados fuera del cuerpo, por ejemplo, en experimentos ex vivo. Estos tampones no contienen hemoglobina, antibióticos o antifúngicos y, por lo tanto, solo son adecuados para preparaciones que involucran pequeñas cantidades de tejido durante un tiempo limitado. El control del pH se logró con el par redox de carbonato y dióxido de carbono, requiriendo una aireación constante del tampón con dióxido de carbono para mantener el equilibrio del pH. Esto es para evitar el uso de otros agentes amortiguadores comunes como HEPES, que puede modificar la función de las células nerviosas¹⁸. Para oxigenar el tampón y proporcionar control del pH, se utilizó una mezcla de 5% de dióxido de carbono en oxígeno llamada carbógeno (95% O₂, 5% CO₂). Se utilizó un agitador de calentamiento para el control de la temperatura de un recipiente tampón, y el tampón se perfundió a través de un baño nervioso y luego se recirculó al recipiente inicial. Un experimento típico duraría 6-8 h antes de que el nervio pierda su viabilidad y ya no responda lo suficiente a la estimulación para que las medidas sean representativas del tejido sano.

Para optimizar la relación señal-ruido, se utilizaron electrodos de cloruro de plata para la grabación, que se prepararon de acuerdo con los métodos descritos anteriormente¹⁹. Para la estimulación, se puede utilizar una combinación de electrodos de manguito de platino comerciales listos para usar y electrodos de manguito de polímero conductor hechos a medida. Los electrodos conductores de manguito de polímero tienen capacidades de carga notablemente más altas, que son útiles cuando se estimula el nervio utilizando formas de onda de alta amplitud²⁰.

El estimulador utilizado en este protocolo ha sido descrito previamente²⁰. La documentación, los archivos de diseño y los scripts de software para usarlo están disponibles públicamente²¹. Se pueden utilizar otros estimuladores para ejecutar este protocolo; sin embargo, el estimulador personalizado también es capaz de bloquear^{el bloque 2,20} de corriente alternativa de alta frecuencia (HFAC^), lo que permite una gama más amplia de experimentos de neurofisiología. Para usar el bloque HFAC, se recomiendan manguitos de elastómero conductor para evitar daños en el nervio. Los manguitos nerviosos de elastómero conductor son matrices de electrodos blandos y totalmente poliméricos producidos a partir de elastómeros conductores como componente conductor y polidimetilsiloxano como aislamiento²². Los dispositivos se fabricaron en una configuración bipolar utilizando técnicas convencionales de microfabricación láser.