Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus Cyanobakterien für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse

Das hier beschriebene Extraktionsprotokoll für die Analyse von NPAAs gilt für die Analyse von Aminosäuren in biologischen Proben. Für Anleitungen zur Isolierung und Kultivierung von Cyanobakterienstämmen kann man sich auf die Methoden beziehen, die in der Studie von Violi et ^al.38 vorgestellt wurden. Der erste Schritt im Protokoll führt die Probe an einen Punkt, an dem eine Normalisierung zwischen den Proben gegen das Trockengewicht erreicht werden kann. Der zweite Schritt ist die Zelllyse zur Freisetzung der Analyten und kann unter Verwendung einer Reihe von Techniken durchgeführt werden, einschließlich mechanischer Unterbrechungen / Lysen wie Sondenbeschallung wie in diesem Protokoll beschrieben, Gefrier- / Tauzyklen, Mahlen und Perlmahlen und nicht-mechanischen Störungen wie enzymatische, Reinigungsmittel und / oder chemische Lyse. Es ist bekannt, dass die mechanische Störung gegenüber nicht-mechanischen vorteilhaft ist, da sie eine größere Kapazität der Probe zur Lyse ermöglicht, während die intrazellulären Bindungen und Proteine intakt bleiben⁴¹, obwohl die Probenmatrix die optimale Methode für die Zelllyse diktieren kann.

Die Proteinfällung ist der kritische dritte Schritt dieses Protokolls bei der Extraktion von Aminosäuren für die Analyse. TCA ist das am häufigsten verwendete Lösungsmittel; Perchlorsäure, Aceton, Methyl-tert-Butylether (MTBE), Methanol und/oder Acetonitril ^8,42 wurden jedoch ebenfalls verwendet, wobei jedes Extraktionslösungsmittel dazu bestimmt ist, verschiedene Substrate zu extrahieren und auszufällen. Das hier beschriebene Modell extrahiert das NPAA BMAA und seine Isomere aus einer cyanobakteriellen Matrix, und obwohl eine Reihe verschiedener Lösungsmittel verwendet wurden, sind die beiden häufigsten 10% TCA in Wasser (wässrig) und 10% TCA in Aceton. Im Allgemeinen wird die Proteinfällung mit TCA häufig verwendet, um Aminosäuren zu extrahieren, um freie Aminosäuren aus den proteingebundenen Aminosäuren zu fraktionieren. Darüber hinaus ermöglicht die TCA-Extraktion die Bestimmung des Gesamtproteingehalts, die Reduzierung von Verunreinigungen für die freie Fraktion und die Verringerung der Aktivität von Proteasen mit minimalem Proteinabbau⁴³. Die TCA-Extraktion der freien Fraktion funktioniert, indem zunächst organisch lösliche Substanzen ausgespült werden, wobei Proteine und unlösliche Verbindungen wie Zellwandreste im Niederschlag zurückbleiben, gefolgt von der thermischen Hydrolyseextraktion der proteingebundenen Aminosäuren (gebundene Fraktion) unter Verwendung einer starken Säure.

Die Fraktionierung der freien Fraktion mit 10% wässrigem TCA plus Ultraschall erzeugt die umfangreichste Proteinfällung im Vergleich zu anderen organischen Lösungsmitteln⁴⁴ und die besten Aminosäuregewinnungsraten⁴². Einige Studien entscheiden sich für die Verwendung einer Säure in Kombination mit einem organischen Lösungsmittel (dh 10% -20% TCA in Aceton 43), um mehr Moleküle, einschließlich kleinerer Peptide / Biomoleküle, auszufällen, den Proteinabbau zu minimieren und Verunreinigungen wie Salze^{zu reduzieren 43}. Ein weiterer Vorteil von 10% TCA in Aceton ist seine schnellere Trocknungsgeschwindigkeit bei der Vorbereitung des Pellets für die Hydrolyse, wodurch Feuchtigkeitsrückstände minimiert werden, um eine Aminosäuremodifikation zu verhindern. 10% wässrige TCA plus Ultraschall hat jedoch eine bessere Extraktionseffizienz von freien Aminosäuren im Vergleich zu 10% TCA in Aceton⁴⁴ allein. Darüber hinaus hat die 10%ige wässrige TCA-Fällung Einschränkungen wie eine lange Trocknungszeit, die nicht in der Lage ist, alle Proteine oder kleine Peptide / Biomoleküle auszufällen, und abhängig vom interessierenden Analyten (dh Proteine oder Aminosäuren), erfordert Zusatzstoffe und Reduktionsmittel, um Oxidation und Abbau zu verhindern^45,46.

Dieses Protokoll verwendet eine Kombination aus 10% wässriger TCA und 10% TCA in Aceton, um die Proteinfällung zu erhöhen, sicherzustellen, dass kleinere Peptide / Biomoleküle gefällt werden, schnellere Pellettrocknungszeiten zu ermöglichen und die Extraktionseffizienz zu erhöhen, wobei beide Lösungsmittelextraktionseigenschaften genutzt werden. Die Kombination von 10% wässriger TCA und 10% TCA in Aceton kann jedoch kleine Peptide / Biomoleküle in der freien Fraktion ausfällen, nachdem die 10% TCA im Acetonüberstand mit der wässrigen freien Fraktion kombiniert wurde. In diesem Fall sollten die Niederschläge zur Hydrolyse in die gebundene Fraktion überführt werden.

Die zweite Hälfte dieses Protokolls beinhaltet die Freisetzung von Aminosäuren (dh BMAA) aus dem Proteinpellet durch Säuredampfhydrolyse bei erhöhten Temperaturen in einer sauerstofffreien Umgebung. Der überwiegende limitierende Faktor für den Hydrolyseschritt ist, dass er zeitaufwendig und mühsam vorzubereiten ist. Die Inkubation über Nacht verhindert eine schnelle und zeiteffiziente Probenvorbereitung und -analyse. Darüber hinaus ist der quantitative Transfer des Pellets von einem Zentrifugenröhrchen in ein Schalenfläschchen (Schritt 3.4) ein mühsamer Prozess, der Sorgfalt und Geduld erfordert, um einen genauen Normalisierungspunkt für das Trockengewicht zu gewährleisten. Mögliche Probleme, mit denen der Benutzer konfrontiert sein kann, sind der unvollständige Transfer des Pellets, nass gefällte Proteine, die an den Pipettenspitzen und dem ursprünglichen Röhrchen haften, und feste Partikel des Pellets, die die Pipettenspitze blockieren. Ein praktischer Vorschlag zur Erleichterung des Transfers des Pellets besteht darin, etwa 0,3-0,5 mm vom Ende der Pipettenspitze mit einer Schere zu entfernen, so dass größere Pelletpartikel gezogen und in die Schalendurchstechflasche abgegeben werden können. Diese Transfermethode ist gängige Praxis bei der Proteinextraktion für alle Aminosäureanalysen. Es sollten jedoch Modifikationen untersucht werden, um die Effizienz und Genauigkeit des quantitativen Transfers des Pellets in die Schalendurchstechflasche zu verbessern.

Zwei Formen von Hydrolysetechniken können verwendet werden, um Aminosäuren aus ihrem proteingebundenen Zustand freizusetzen: Flüssigphasenhydrolyse und Säuredampfhydrolyse. Die Flüssigphasenhydrolyse, bei der der Probe 6 M HCl zugegeben werden, die dann über Nacht in einen 110 °C-Ofen gegeben wird, ist eine Alternative zu der in diesem Protokoll beschriebenen Säuredampfhydrolyse. Extraktionstechniken, die Flüssigphasenhydrolyse verwenden, können eine weitere Verarbeitung erfordern, wie z. B. Entsalzung, insbesondere wenn die AQC-Derivatisierung gewählt wird, da sie grundlegende Bedingungen für die Markierung⁴⁰ erfordert. Die Säuredampfhydrolyse vermeidet die Entsalzung und gibt dem Anwender die Freiheit, die Derivatisierungstechnik nach der Rekonstitution des endgültigen Pellets vor der Filtration zu wählen. Darüber hinaus können die Proben unabhängig von der gewählten Hydrolysemethode eine weitere Verarbeitung erfordern, wie z. B. SPE für die Matrixreinigung und die Konzentration 29,47,48^, abhängig von der Wahl der Derivatisierungstechnik und/oder analytischen Analyse (z. B. UMKEHRPHASEN-LC-MS/MS vs. hydrophile Wechselwirkung Flüssigkeitschromatographie [HILIC] LC-MS/MS ³⁷ ). Die Rekonstitution des endgültigen Pellets in 20 mM HCl in diesem Protokoll ist für die Derivatisierung unter Verwendung von PCF-Reagenzien⁴⁸über ein kommerziell erhältliches Aminosäurehydrolysekit³⁹ geeignet (siehe Materialtabelle). Sowohl AQC als auch PCF werden alle Aminosäuren, Proteine und Nicht-Proteine derivatisieren, die in der Probe vorhanden sind, und die Selektivität der Analyten wird durch die Verwendung von LC-MS / MS und seiner Kombination aus Retentionszeitanpassung und sorgfältiger Auswahl des Quantifizierers und Qualifizierers MRMs³⁸ erhalten. 

Aktuelle Hydrolyseprotokolle sind nicht für die Freisetzung von BMAA, 2,4-DAB und AEG optimiert, sondern für die 22 Proteinaminosäuren, die auf bestehenden Methoden zur Proteinhydrolyse 32 basieren, bei denen eine Inkubation über mehr als 18 h zum Abbau und zur Modifikation bestimmter Aminosäuren führt, was die LC-MS/MS-Analyse und damit die erhaltenen Konzentrationen^{beeinflusst 32}. Beach et ^al.49 untersuchten die Hydrolyse über die Zeit (0,5-120 h), um die Hydrolyse für die Analyse von BMAA und den proteinogenen Aminosäuren zu optimieren. Sie fanden heraus, dass, obwohl es während der ersten 0,5 Stunden der Hydrolyse eine frühe schnelle Freisetzung von BMAA gab, die BMAA-Werte mit zunehmender Hydrolysezeit ohne Abbau auch nach 5 Tagen weiter anstiegen⁴⁹. Es gibt auch immer noch unterschiedliche Ansichten und Fragen über die wahre Natur von gebundenem BMAA und seinen Isomeren, wobei einige Studien darauf hindeuten, dass die BMAA-Protein-Assoziation eher oberflächlich ist 52 als BMAA-Bindung^50,51 oder Fehlinkorporation in Proteine¹⁴. Der derzeitige Konsens in der Analyse von “gebundenem” BMAA erfordert jedoch den validierten und weithin akzeptierten Hydrolyseschritt, der Peptide / Proteine zerlegt, um Aminosäuren und damit BMAA und seine Isomere freizusetzen.

Die Wiederfindungsraten von 20 Proteinaminosäuren wurden in einer Studie von Sedgwick et ^al.42 unter Verwendung der TCA-Extraktion bestimmt, was zu einer etwa 100%igen Erholung führte. Im Fall von BMAA und seinen Isomeren aus Algenmatrices haben Studien, die die Effizienz der BMAA-Extraktion mit verschiedenen Extraktionslösungsmitteln vergleichen, ergeben, dass 10% TCA das effizienteste für freies BMAA²⁷ ist. Die Wiederfindungsraten für proteingebundenes BMAA, das mittels Flüssigphasenhydrolyse extrahiert wurde, wurden in Studien von Glover et ^al.25 und Faassen et ^al.53 ermittelt, wo die Genauigkeit durch Spiked-Recovery-Methoden mit einer durchschnittlichen BMAA-Wiederfindungsrate von 108,6% bzw. 70% bestimmt wurde. Faassen et al. beschrieben Verfahren für Spike-Recovery-Experimente und zeigten, wie sich die Gewinnung in Abhängigkeit von der Phase des Extraktionsprozesses unterscheidet, in dem der Spike gemacht wurde⁵³. Faassen et al. bestimmten zusätzlich die Effizienz des hier vorgestellten Säuredampfprotokolls mit Wiederfindungsraten von 83,6% für die BMAA-Isomere, die vor der Extraktion und 68,6% für die vor der Hydrolyse aufgespießt wurden²⁴. Diese Gewinnungsraten, Extraktionsmethoden und Analysen wurden von Banack 26 weiter validiert, mit Wiederfindungsraten von 94 % bis 106 % für BMAA in einer cyanobakteriellen Matrix und einer %relativen Standardabweichung (%RSD) zwischen 5,6 % und²⁰ %, die die FDA-Kriterien für Genauigkeit⁵⁴ erfüllten. Es wird empfohlen, dass jedes Labor zunächst seine Wiederfindungsraten und Genauigkeit ermittelt, bevor dieses Protokoll über Spike-Recovery-Experimente verwendet wird. Die in Faassen et ^al.53 und Glover et ^al.25 vorgestellten Wiederfindungsmethoden können als Anhaltspunkt herangezogen werden.

Alternative Formen der Hydrolysetechniken können anstelle der Nachtofenhydrolyse verwendet werden, um eine schnellere proteingebundene Extraktion des Analyten zu erreichen. Zum Beispiel könnte ein Mikrowellenextraktor die Hydrolysezeit von 24 h auf nur 10 min⁵⁵ deutlich reduzieren. Die Mikrowellenhydrolyse für Aminosäuren verwendet die gleichen Prinzipien wie die herkömmliche thermische Methode, wobei ein Handschuhfach verwendet wird, um das Mikrowellengefäß in einer sauerstofffreien Umgebung vorzubereiten und zusammenzubauen und 6 M HCl hinzuzufügen. Sobald es luftdicht ist, wird das Gefäß, das die Probe enthält, Mikrowellenstrahlung unterzogen. Mikrowellenhydrolyse wurde verwendet, um Aminosäuren aus verschiedenen Probenmatrices^56,57,58 zu extrahieren; Die Mikrowellenhydrolyse muss jedoch noch für die Analyse von BMAA entwickelt und validiert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die 10%ige wässrige TCA-Proteinfällung die optimale Methode ist, um freie Nicht-Protein-Aminosäuren aus cyanobakteriellen Matrices²⁷ zu extrahieren, und die thermische Hydrolyse bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Extraktion der proteingebundenen Fraktion. Dieses Protokoll zur Extraktion des NPAA BMAA und seiner Isomere aus Cyanobakterien ist validiert und weithin akzeptiert. Zukünftige Richtungen zur weiteren Optimierung der BMAA-Extraktion werden sich auf den Hydrolyseschritt konzentrieren, der gemäß den Spezifikationen der 22 Proteinaminosäuren durchgeführt wird. Das hier vorgestellte Extraktionsprotokoll sollte jedoch dennoch als effizient und effektiv für die Analyse von BMAA und seinen Isomeren mittels LC-MS/MS angesehen werden.