Extractie van niet-eiwit aminozuren uit cyanobacteriën voor vloeistofchromatografie- tandem massaspectrometrieanalyse

Het extractieprotocol dat hier wordt beschreven voor de analyse van NPAAs is van toepassing op het analyseren van aminozuren in biologische monsters. Voor gidsen over het isoleren en kweken van cyanobacteriële stammen kan men verwijzen naar de methoden die in de studie van Violi et ^al.38 worden gepresenteerd. De eerste stap in het protocol brengt het monster naar een punt waar normalisatie tussen monsters tegen het droge gewicht kan worden bereikt. De tweede stap is cellyse om de analyten vrij te geven en kan worden uitgevoerd met behulp van een reeks technieken, waaronder mechanische verstoringen / lyses zoals sonde-sonicatie zoals beschreven in dit protocol, vries- / dooicycli, malen en kraalfrezen, en niet-mechanische verstoringen zoals enzymatische, detergentische en / of chemische lysis. Het is bekend dat mechanische verstoring voordelig is ten opzichte van niet-mechanische, omdat het een grotere capaciteit van het monster mogelijk maakt om te lyseren, terwijl de intracellulaire bindingen en eiwitten intact blijven⁴¹, hoewel de monstermatrix de optimale methode voor cellyseren kan dicteren.

Eiwitprecipitatie is de kritieke derde stap van dit protocol bij het extraheren van aminozuren voor analyse. TCA is het meest gebruikte oplosmiddel; perchloorzuur, aceton, methyltert-butylether (MTBE), methanol en/of acetonitril ^8,42 zijn echter ook gebruikt, waarbij elk extractieoplosmiddel bedoeld is om verschillende substraten te extraheren en neer te slaan. Het hier beschreven model haalt de NPAA BMAA en zijn isomeren uit een cyanobacteriële matrix, en hoewel een reeks verschillende oplosmiddelen zijn gebruikt, zijn de twee meest voorkomende 10% TCA in water (waterig) en 10% TCA in aceton. Over het algemeen wordt eiwitprecipitatie met TCA vaak gebruikt om aminozuren te extraheren om vrije aminozuren uit de eiwitgebonden aminozuren te fractioneren. Bovendien maakt TCA-extractie het mogelijk om het totale eiwitgehalte te bepalen, verontreinigingen voor de vrije fractie te verminderen en de activiteit van proteasen te verminderen met minimale eiwitafbraak⁴³. De TCA-extractie van de vrije fractie werkt door in eerste instantie organisch oplosbare stoffen uit te spoelen, waarbij eiwitten en onoplosbare verbindingen zoals celwandresten in het neerslag achterblijven, wat vervolgens wordt gevolgd door thermische hydrolyse-extractie van de eiwitgebonden aminozuren (gebonden fractie) met behulp van een sterk zuur.

De fractionering van de vrije fractie met 10% waterige TCA plus ultrasoonapparaat produceert de meest uitgebreide eiwitprecipitatie in vergelijking met andere organische oplosmiddelen⁴⁴ en de beste aminozuurterugwinningen⁴². Sommige studies kiezen ervoor om een zuur te gebruiken in combinatie met een organisch oplosmiddel (d.w.z. 10% -20% TCA in aceton⁴³) om meer moleculen neer te slaan, waaronder kleinere peptiden / biomoleculen, eiwitafbraak te minimaliseren en verontreinigingen zoals zouten^{te verminderen 43}. Een ander voordeel van 10% TCA in aceton is de snellere droogsnelheid bij de bereiding van de pellet voor hydrolyse, waardoor vochtresten worden geminimaliseerd om aminozuurmodificatie te voorkomen. 10% waterige TCA plus ultrasoonapparaat heeft echter een betere extractie-efficiëntie van vrije aminozuren in vergelijking met 10% TCA in aceton⁴⁴ alleen. Bovendien heeft 10% waterige TCA-precipitatie beperkingen zoals een lange droogtijd, niet in staat zijn om alle eiwitten of kleine peptiden / biomoleculen neer te slaan, en afhankelijk van de analyt van belang (d.w.z. eiwitten of aminozuren), waarvoor additieven en reductiemiddelen nodig zijn om oxidatie en afbraak te voorkomen^45,46.

Dit protocol maakt gebruik van een combinatie van 10% waterige TCA en 10% TCA in aceton om eiwitprecipitatie te verhogen, ervoor te zorgen dat kleinere peptiden / biomoleculen worden neergeslagen, snellere pelletdroogtijden mogelijk te maken en de extractie-efficiëntie te verhogen, gebruikmakend van beide oplosmiddelextractie-eigenschappen. De combinatie van 10% waterige TCA en 10% TCA in aceton kan echter kleine peptiden/biomoleculen in de vrije fractie neerslaan nadat de 10% TCA in aceton supernatant is gecombineerd met de waterige vrije fractie. In dit geval moeten de neerslagen worden overgebracht naar de gebonden fractie voor hydrolyse.

De tweede helft van dit protocol omvat het vrijkomen van aminozuren (d.w.z. BMAA) uit de eiwitpellet via zuurdamphydrolyse bij verhoogde temperaturen in een zuurstofvrije omgeving. De overwegend beperkende factor voor de hydrolysestap is dat het tijdrovend en arbeidsintensief is om te bereiden. De nachtelijke incubatie voorkomt een snelle en tijdefficiënte monstervoorbereiding en -analyse. Bovendien is de kwantitatieve overdracht van de pellet van een centrifugebuis naar een injectieflacon (stap 3.4) een moeizaam proces dat toewijding en geduld vereist om een nauwkeurig normalisatiepunt voor het droge gewicht te garanderen. Mogelijke problemen waarmee de gebruiker te maken kan krijgen, zijn de onvolledige overdracht van de pellet, natte neergeslagen eiwitten die aan pipetpunten en de originele buis kleven, en vaste deeltjes van de pellet die de pipetpunt blokkeren. Een praktische suggestie om een gemakkelijkere overdracht van de pellet te vergemakkelijken, is om ongeveer 0,3-0,5 mm van het uiteinde van de pipetpunt te verwijderen met een schaar, waardoor grotere pelletdeeltjes kunnen worden getrokken en in de injectieflacon van de schaal kunnen worden vrijgegeven. Deze overdrachtsmethode is gebruikelijk voor eiwitextractie voor alle aminozuuranalyses. Er moeten echter wijzigingen worden onderzocht om de efficiëntie en nauwkeurigheid van het kwantitatief overbrengen van de pellet in de injectieflacon in de schaal te verbeteren.

Twee vormen van hydrolysetechnieken kunnen worden gebruikt om aminozuren vrij te maken uit hun eiwitgebonden toestand: vloeibare fasehydrolyse en zuurdamphydrolyse. Vloeistoffasehydrolyse, waarbij 6 M HCl aan het monster wordt toegevoegd, dat vervolgens ‘s nachts in een oven van 110 °C wordt geplaatst, is een alternatief voor de zuurdamphydrolyse die in dit protocol wordt beschreven. Extractietechnieken die hydrolyse in vloeibare fase gebruiken, kunnen verdere verwerking vereisen, zoals ontzilting, vooral als AQC-derivatisatie wordt gekozen, omdat het basisvoorwaarden vereist voor het labelen^{van 40}. Zuurdamphydrolyse vermijdt ontzilting en geeft de gebruiker de vrijheid om de derivatisatietechniek te kiezen bij reconstitutie van de uiteindelijke pellet vóór filtratie. Bovendien kunnen de monsters, onafhankelijk van de gekozen hydrolysemethode, verdere verwerking vereisen, zoals SPE voor matrixzuivering en concentratie 29,47,48, afhankelijk van de keuze van de derivatisatietechniek en/of analytische analyse (bijv. omgekeerde fase LC-MS/MS versus hydrofiele interactievloeistofchromatografie [HILIC] LC-MS/MS ³⁷ ). De reconstitutie van de uiteindelijke pellet in 20 mM HCl in dit protocol is geschikt voor derivatisatie met behulp van PCF-reagentia⁴⁸via een in de handel verkrijgbare aminozuurhydrolysekit³⁹ (zie Materiaaltabel). Zowel AQC als PCF zullen alle aminozuren, eiwitten en niet-eiwitten in oorsprong in het monster derivatiseren, en de selectiviteit van de analyten wordt verkregen door het gebruik van LC-MS / MS en de combinatie van retentietijdmatching en zorgvuldige selectie van de kwantor en kwalificatie-MRM’s³⁸. 

De huidige hydrolyseprotocollen zijn niet geoptimaliseerd voor de afgifte van BMAA, 2,4-DAB en AEG, maar voor de 22 eiwitaminozuren op basis van bestaande methoden voor eiwithydrolyse³², waarbij incubatie gedurende langer dan 18 uur resulteert in de afbraak en wijziging van bepaalde aminozuren, wat van invloed is op de LC-MS / MS-analyse en dus de verkregen concentraties³². Beach et ^al.49 onderzochten hydrolyse in de loop van de tijd (0,5-120 uur) om de hydrolyse te optimaliseren voor het analyseren van BMAA en de proteïnogene aminozuren. Ze ontdekten dat hoewel er een vroege snelle afgifte van BMAA was tijdens de eerste 0,5 uur van de hydrolyse, de BMAA-niveaus bleven toenemen naarmate de hydrolysetijd toenam, zonder degradatie, zelfs na 5 dagen⁴⁹. Er zijn ook nog steeds verschillende opvattingen en vragen over de ware aard van gebonden BMAA en zijn isomeren, waarbij sommige studies suggereren dat in plaats van BMAA-binding^50,51 of misincorporatie in eiwitten¹⁴, BMAA-eiwitassociatie oppervlakkig is⁵². De huidige consensus in de analyse van “gebonden” BMAA vereist echter de gevalideerde en algemeen aanvaarde hydrolysestap die peptiden / eiwitten uit elkaar haalt om aminozuren en dus BMAA en zijn isomeren vrij te maken.

De herstelpercentages van 20 eiwitaminozuren werden bepaald in een studie door Sedgwick et ^al.42 met behulp van TCA-extractie, wat resulteerde in ongeveer 100% herstel. In het geval van BMAA en zijn isomeren uit algenmatrices, hebben studies die de efficiëntie van BMAA-extractie met behulp van verschillende extractiemiddelen vergelijken, aangetoond dat 10% TCA het meest efficiënt is voor gratis BMAA²⁷. De herstelpercentages voor eiwitgebonden BMAA geëxtraheerd met behulp van vloeibare fasehydrolyse werden vastgesteld in studies door Glover et ^al.25 en door Faassen et ^al.53, waarbij de nauwkeurigheid werd bepaald door spiked recovery-methoden, met een gemiddeld BMAA-herstelpercentage van respectievelijk 108,6% en 70%. Faassen et al. beschreven procedures voor spike-recovery experimenten en illustreerden hoe het herstel verschilt afhankelijk van het stadium van het extractieproces waarin de spike werd gemaakt⁵³. Faassen et al. bepaalden bovendien de efficiëntie van het hier gepresenteerde zuur-dampprotocol, met herstelpercentages van 83,6% voor de BMAA-isomeren die piekten voorafgaand aan extractie en 68,6% voor degenen die piekten vóór hydrolyse²⁴. Deze herstelbewerkingen, extractiemethoden en analyses werden verder gevalideerd door Banack²⁶, met herstelpercentages van 94% -106% voor BMAA in een cyanobacteriële matrix en een %relatieve standaarddeviatie (% RSD) tussen 5,6% en 20%, die voldoen aan de FDA-criteria voor nauwkeurigheid⁵⁴. Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium in eerste instantie zijn herstelpercentages en nauwkeurigheid vaststelt voordat dit protocol wordt gebruikt via spike-herstelexperimenten. De herstelmethoden in Faassen et ^al.53 en Glover et ^al.25 kunnen als leidraad worden gevolgd.

Alternatieve vormen van hydrolysetechnieken kunnen worden gebruikt in plaats van nachtelijke ovenhydrolyse voor snellere eiwitgebonden extractie van de analyt. Een magnetronafzuiging kan bijvoorbeeld de hydrolysetijd aanzienlijk verkorten van 24 uur tot slechts 10 minuten⁵⁵. Microgolfhydrolyse voor aminozuren gebruikt dezelfde principes als de conventionele thermische methode, waarbij een handschoenenkastje wordt gebruikt om het microgolfvat in een zuurstofvrije omgeving te bereiden en te assembleren en 6 M HCl wordt toegevoegd. Eenmaal luchtdicht, ondergaat het vat dat het monster bevat microgolfstraling. Microgolfhydrolyse is gebruikt om aminozuren te extraheren uit verschillende monstermatrices 56,57,58; microgolfhydrolyse moet echter nog worden ontwikkeld en gevalideerd voor de analyse van BMAA.

Kortom, 10% waterige TCA-eiwitprecipitatie is de optimale methode om vrije niet-eiwitaminozuren uit cyanobacteriële matrices²⁷ te extraheren, en thermische hydrolyse zorgt voor een betrouwbare en reproduceerbare extractie van de eiwitgebonden fractie. Dit protocol om de NPAA BMAA en zijn isomeren uit cyanobacteriën te extraheren, is gevalideerd en algemeen aanvaard. Toekomstige aanwijzingen om de extractie van BMAA verder te optimaliseren, zullen zich richten op de hydrolysestap, die wordt uitgevoerd volgens de specificaties van de 22 eiwitaminozuren. Het hier gepresenteerde extractieprotocol moet echter nog steeds als efficiënt en effectief worden beschouwd voor het analyseren van BMAA en zijn isomeren via LC-MS / MS.