Extracción de aminoácidos no proteicos de cianobacterias para cromatografía líquida-análisis de espectrometría de masas en tándem

El protocolo de extracción descrito aquí para el análisis de NPAA se aplica al análisis de cualquier aminoácido en muestras biológicas. Para las guías de aislamiento y cultivo de cepas de cianobacterias, se pueden consultar los métodos presentados en el estudio de Violi et ^al.38. El primer paso en el protocolo lleva la muestra a un punto en el que se puede lograr la normalización entre muestras contra el peso seco. El segundo paso es la lisis celular para liberar los analitos y se puede realizar utilizando una variedad de técnicas, incluidas interrupciones / lisis mecánicas como la sonicación de la sonda como se describe en este protocolo, ciclos de congelación / descongelación, molienda y molienda de perlas, e interrupciones no mecánicas como enzimática, detergente y / o lisis química. Se sabe que la interrupción mecánica es ventajosa sobre la no mecánica, ya que permite una mayor capacidad de la muestra para lisarse, al tiempo que permite que los enlaces intracelulares y las proteínas permanezcan intactos⁴¹, aunque la matriz de la muestra puede dictar el método óptimo para la lisis celular.

La precipitación de proteínas es el tercer paso crítico de este protocolo cuando se extraen aminoácidos para su análisis. El TCA es el disolvente más utilizado; sin embargo, también se han utilizado ácido perclórico, acetona, metil terc-butil éter (MTBE), metanol y/o acetonitrilo ^8,42, donde cada disolvente de extracción está destinado a extraer y precipitar diferentes sustratos. El modelo descrito aquí extrae el NPAA BMAA y sus isómeros de una matriz cianobacteriana, y aunque se ha utilizado una gama de disolventes diferentes, los dos más comunes son 10% TCA en agua (acuosa) y 10% TCA en acetona. En general, la precipitación de proteínas con TCA se usa comúnmente para extraer aminoácidos para fraccionar aminoácidos libres de los aminoácidos unidos a proteínas. Además, la extracción de TCA permite determinar el contenido total de proteínas, reducir los contaminantes para la fracción libre y reducir la actividad de las proteasas con una degradación mínima de proteínas⁴³. La extracción con TCA de la fracción libre funciona enjuagando inicialmente las sustancias solubles orgánicas, dejando atrás proteínas y compuestos insolubles como los restos de la pared celular en el precipitado, que luego es seguido por la extracción por hidrólisis térmica de los aminoácidos unidos a proteínas (fracción unida) utilizando un ácido fuerte.

El fraccionamiento de la fracción libre con 10% de TCA acuoso más sonicación produce la precipitación proteica más extensa en comparación con otros disolventes orgánicos⁴⁴ y las mejores recuperaciones de aminoácidos⁴². Algunos estudios optan por usar un ácido combinado con un solvente orgánico (es decir, 10% -20% de TCA en acetona 43) para precipitar más moléculas, incluyendo péptidos / biomoléculas más pequeños, minimizar la degradación de proteínas y reducir contaminantes como las sales⁴³. Otra ventaja del 10% de TCA en acetona es su velocidad de secado más rápida en la preparación del pellet para hidrólisis, minimizando el residuo de humedad para evitar la modificación de aminoácidos. Sin embargo, el 10% de TCA acuoso más sonicación tiene mejores eficiencias de extracción de aminoácidos libres en comparación con el 10% de TCA en acetona⁴⁴ solo. Además, la precipitación acuosa de TCA al 10% tiene limitaciones como un largo tiempo de secado, no poder precipitar todas las proteínas o péptidos/biomoléculas pequeños, y dependiendo del analito de interés (es decir, proteínas o aminoácidos), requerir aditivos y agentes reductores para prevenir la oxidación y degradación^45,46.

Este protocolo utiliza una combinación de 10% de TCA acuoso y 10% de TCA en acetona para aumentar la precipitación de proteínas, garantizar que se precipiten péptidos / biomoléculas más pequeños, permitir tiempos de secado de pellets más rápidos y aumentar la eficiencia de extracción, aprovechando ambas propiedades de extracción con solvente. Sin embargo, la combinación de 10% de TCA acuoso y 10% de TCA en acetona puede precipitar pequeños péptidos/biomoléculas en la fracción libre después de que el 10% de TCA en sobrenadante de acetona se combine con la fracción libre acuosa. En este caso, los precipitados deben transferirse a la fracción unida para la hidrólisis.

La segunda mitad de este protocolo implica la liberación de aminoácidos (es decir, BMAA) del pellet de proteína a través de la hidrólisis ácido-vapor a temperaturas elevadas en un ambiente libre de oxígeno. El factor predominantemente limitante para el paso de hidrólisis es que requiere mucho tiempo y es laborioso prepararlo. La incubación nocturna impide una preparación y análisis de muestras rápidos y eficientes en el tiempo. Además, la transferencia cuantitativa del pellet de un tubo de centrífuga a un vial de carcasa (paso 3.4) es un proceso arduo que requiere diligencia y paciencia para garantizar un punto preciso de normalización al peso seco. Los posibles problemas que el usuario puede enfrentar son la transferencia incompleta del pellet, las proteínas precipitadas húmedas que se adhieren a las puntas de la pipeta y al tubo original, y las partículas sólidas del pellet que bloquean la punta de la pipeta. Una sugerencia práctica para facilitar la transferencia del pellet es quitar aproximadamente 0.3-0.5 mm del extremo de la punta de la pipeta con un par de tijeras, lo que permite extraer partículas de pellets más grandes y liberarlas en el vial de la cáscara. Este método de transferencia es una práctica común para la extracción de proteínas para todos los análisis de aminoácidos. Sin embargo, se deben investigar modificaciones para mejorar la eficiencia y precisión de la transferencia cuantitativa del pellet al vial de la cáscara.

Se pueden emplear dos formas de técnicas de hidrólisis para liberar aminoácidos de su estado unido a proteínas: hidrólisis en fase líquida e hidrólisis ácido-vapor. La hidrólisis en fase líquida, que implica la adición de HCl 6 M a la muestra, que luego se coloca en un horno a 110 °C durante la noche, es una alternativa a la hidrólisis ácido-vapor descrita en este protocolo. Las técnicas de extracción que emplean hidrólisis en fase líquida pueden requerir un procesamiento adicional, como la desalinización, especialmente si se elige la derivatización AQC, ya que requiere condiciones básicas para el marcado⁴⁰. La hidrólisis ácido-vapor evita la desalinización y permite al usuario la libertad de elegir la técnica de derivatización tras la reconstitución del pellet final antes de la filtración. Además, independientemente del método de hidrólisis elegido, las muestras pueden requerir un procesamiento adicional, como SPE para purificación de matriz y concentración 29,47,48, dependiendo de la elección de la técnica de derivatización y / o análisis analítico (por ejemplo^, fase inversa LC-MS / MS vs. cromatografía líquida de interacción hidrófila [HILIC] LC-MS / MS ³⁷ ). La reconstitución del pellet final en 20 mM HCl en este protocolo es apropiada para la derivatización utilizando reactivos PCF⁴⁸a través de un kit de hidrólisis de aminoácidos disponible comercialmente³⁹ (ver Tabla de materiales). Tanto AQC como PCF derivarán todos los aminoácidos, proteínas y no proteínas de origen presentes en la muestra, y la selectividad de los analitos se obtiene mediante el uso de LC-MS/MS y su combinación de coincidencia de tiempo de retención y selección cuidadosa del cuantificador y calificador MRMs³⁸. 

Los protocolos actuales de hidrólisis no están optimizados para la liberación de BMAA, 2,4-DAB y AEG, sino para los 22 aminoácidos proteicos basados en los métodos existentes para la hidrólisis de proteínas 32, donde la incubación por más de 18 h resulta en la degradación y modificación de ciertos aminoácidos, afectando el análisis LC-MS/MS y, por lo tanto, las concentraciones obtenidas³². Beach et ^al.49 investigaron la hidrólisis a lo largo del tiempo (0,5-120 h) para optimizar la hidrólisis para analizar BMAA y los aminoácidos proteinogénicos. Encontraron que aunque hubo una liberación rápida temprana de BMAA durante las primeras 0,5 h de la hidrólisis, los niveles de BMAA continuaron aumentando a medida que aumentaba el tiempo de hidrólisis, sin degradación, incluso después de 5 días⁴⁹. También hay diferentes puntos de vista y preguntas sobre la verdadera naturaleza de BMAA unido y sus isómeros, con algunos estudios que sugieren que en lugar de BMAA enlazar 50,51 o incorporarse erróneamente a las proteínas^14, la asociación BMAA-proteína es superficial⁵². Sin embargo, el consenso actual en el análisis de BMAA “unido” requiere el paso de hidrólisis validado y ampliamente aceptado que rompe los péptidos / proteínas para liberar aminoácidos y, por lo tanto, BMAA y sus isómeros.

Las tasas de recuperación de 20 aminoácidos proteicos se determinaron en un estudio realizado por Sedgwick et ^al.42 utilizando la extracción de TCA, resultando en aproximadamente un 100% de recuperación. En el caso de BMAA y sus isómeros de matrices de algas, los estudios que comparan la eficiencia de la extracción de BMAA utilizando varios disolventes de extracción han encontrado que el 10% de TCA es el más eficiente para BMAA^{libre 27}. Las tasas de recuperación para el BMAA unido a proteínas extraído mediante hidrólisis en fase líquida se establecieron en estudios de Glover et ^al.25 y de Faassen et ^al.53, donde la precisión se determinó mediante métodos de recuperación con picos, con una tasa media de recuperación de BMAA de 108,6% y 70%, respectivamente. Faassen et al. describieron procedimientos para experimentos de recuperación de picos e ilustraron cómo la recuperación difiere dependiendo de la etapa del proceso de extracción del pico que se realizó⁵³. Faassen et al. determinaron adicionalmente la eficiencia del protocolo ácido-vapor presentado aquí, con tasas de recuperación de 83,6% para los isómeros BMAA aumentados antes de la extracción y 68,6% para los que se dispararon antes de la hidrólisis²⁴. Estas recuperaciones, métodos de extracción y análisis fueron validados por Banack 26, con tasas de recuperación del 94%-106% para BMAA en una matriz de cianobacterias y una %Desviación Estándar Relativa (%RSD) entre 5.6% y²⁰%, cumpliendo con los criterios de precisión de la FDA⁵⁴. Se recomienda que cada laboratorio establezca inicialmente sus tasas de recuperación y precisión antes de utilizar este protocolo a través de experimentos de recuperación de picos. Los métodos de recuperación presentados en Faassen et ^al.53 y Glover et ^al.25 pueden seguirse como guía.

Se pueden utilizar formas alternativas de técnicas de hidrólisis en lugar de la hidrólisis de horno durante la noche para una extracción más rápida del analito unida a proteínas. Por ejemplo, un extractor de microondas podría reducir significativamente el tiempo de hidrólisis de 24 h a tan solo 10 min⁵⁵. La hidrólisis por microondas para aminoácidos utiliza los mismos principios que el método térmico convencional, utilizando una guantera para preparar y ensamblar el recipiente de microondas en un ambiente libre de oxígeno y agregando HCl 6 M. Una vez hermético, el recipiente que contiene la muestra sufre radiación de microondas. La hidrólisis por microondas se ha utilizado para extraer aminoácidos de diversas matrices de muestra^56,57,58; sin embargo, la hidrólisis por microondas aún no se ha desarrollado y validado para el análisis de BMAA.

En conclusión, la precipitación acuosa de proteína TCA al 10% es el método óptimo para extraer aminoácidos no proteicos libres de matrices cianobacterianas²⁷, y la hidrólisis térmica proporciona una extracción confiable y reproducible de la fracción unida a proteínas. Este protocolo para extraer el NPAA BMAA y sus isómeros de cianobacterias está validado y ampliamente aceptado. Las direcciones futuras para optimizar aún más la extracción de BMAA se centrarán en el paso de hidrólisis, que se realiza de acuerdo con las especificaciones de los 22 aminoácidos proteicos. Sin embargo, el protocolo de extracción presentado aquí aún debe considerarse eficiente y efectivo para analizar BMAA y sus isómeros a través de LC-MS / MS.