Estrazione di aminoacidi non proteici da cianobatteri per cromatografia liquida-analisi di spettrometria di massa tandem

Il protocollo di estrazione qui delineato per l’analisi degli NPAA si applica all’analisi di qualsiasi amminoacido nei campioni biologici. Per le guide sull’isolamento e la coltura di ceppi cianobatterici, si può fare riferimento ai metodi presentati nello studio di Violi et ^al.38. Il primo passo del protocollo porta il campione a un punto in cui è possibile ottenere la normalizzazione tra i campioni rispetto al peso secco. La seconda fase è la lisi cellulare per rilasciare gli analiti e può essere eseguita utilizzando una serie di tecniche, tra cui interruzioni / lisi meccaniche come la sonicazione della sonda come descritto in questo protocollo, cicli di congelamento / disgelo, macinazione e fresatura delle perline e interruzioni non meccaniche come lisi enzimatica, detergente e / o chimica. La rottura meccanica è nota per essere vantaggiosa rispetto a quella non meccanica in quanto consente una maggiore capacità del campione di lisare consentendo ai legami intracellulari e alle proteine di rimanere intatti⁴¹, sebbene la matrice del campione possa dettare il metodo ottimale per la lisi cellulare.

La precipitazione proteica è il terzo passo critico di questo protocollo quando si estraggono gli amminoacidi per l’analisi. Il TCA è il solvente più comunemente usato; tuttavia, sono stati utilizzati anche acido perclorico, acetone, metil terz-butil etere (MTBE), metanolo e/o acetonitrile ^8,42, in cui ciascun solvente di estrazione ha lo scopo di estrarre e precipitare substrati diversi. Il modello qui descritto estrae il BMAA NPAA e i suoi isomeri da una matrice cianobatterica e, sebbene sia stata utilizzata una gamma di solventi diversi, i due più comuni sono il 10% di TCA in acqua (acquosa) e il 10% di TCA in acetone. In generale, la precipitazione proteica con TCA è comunemente usata per estrarre aminoacidi per frazionare gli amminoacidi liberi dagli amminoacidi legati alle proteine. Inoltre, l’estrazione TCA consente di determinare il contenuto proteico totale, riducendo i contaminanti per la frazione libera e riducendo l’attività delle proteasi con una degradazione minima delle proteine⁴³. L’estrazione TCA della frazione libera funziona inizialmente risciacquando le sostanze solubili organiche, lasciando dietro di sé proteine e composti insolubili come i resti della parete cellulare nel precipitato, che viene poi seguita dall’estrazione termica dell’idrolisi degli amminoacidi legati alle proteine (frazione legata) utilizzando un acido forte.

Il frazionamento della frazione libera con TCA acquoso al 10% più sonicazione produce la precipitazione proteica più estesa rispetto ad altri solventi organici⁴⁴ e i migliori recuperi di aminoacidi⁴². Alcuni studi scelgono di utilizzare un acido combinato con un solvente organico (cioè 10% -20% TCA in acetone 43) per precipitare più molecole, compresi peptidi / biomolecole più piccoli, ridurre al minimo la degradazione proteica e ridurre i contaminanti come i sali⁴³. Un altro vantaggio del 10% di TCA nell’acetone è la sua velocità di essiccazione più rapida nella preparazione del pellet per l’idrolisi, riducendo al minimo i residui di umidità per prevenire la modifica degli aminoacidi. Tuttavia, il 10% di TCA acquoso più sonicazione ha migliori efficienze di estrazione degli aminoacidi liberi rispetto al 10% di TCA nel solo acetone⁴⁴. Inoltre, la precipitazione acquosa di TCA al 10% ha limitazioni come un lungo tempo di essiccazione, non essendo in grado di precipitare tutte le proteine o piccoli peptidi / biomolecole e, a seconda dell’analita di interesse (cioè proteine o amminoacidi), che richiedono additivi e agenti riducenti per prevenire l’ossidazione e la degradazione^45,46.

Questo protocollo utilizza una combinazione di TCA acquoso al 10% e TCA al 10% in acetone per aumentare la precipitazione proteica, garantire che peptidi / biomolecole più piccoli vengano precipitati, consentire tempi di essiccazione del pellet più rapidi e aumentare l’efficienza di estrazione, sfruttando entrambe le proprietà di estrazione con solvente. Tuttavia, la combinazione del 10% di TCA acquoso e del 10% di TCA nell’acetone può precipitare piccoli peptidi / biomolecole nella frazione libera dopo che il 10% di TCA nell’acetone surnatante è combinato con la frazione libera acquosa. In questo caso, i precipitati devono essere trasferiti nella frazione legata per l’idrolisi.

La seconda metà di questo protocollo prevede il rilascio di aminoacidi (cioè BMAA) dal pellet proteico tramite idrolisi acido-vapore a temperature elevate in un ambiente privo di ossigeno. Il fattore prevalentemente limitante per la fase di idrolisi è che richiede tempo e laborioso da preparare. L’incubazione notturna impedisce una preparazione e un’analisi dei campioni rapida ed efficiente in termini di tempo. Inoltre, il trasferimento quantitativo del pellet da un tubo di centrifuga a una fiala di guscio (fase 3.4) è un processo arduo che richiede diligenza e pazienza per garantire un preciso punto di normalizzazione al peso secco. I possibili problemi che l’utente può incontrare sono il trasferimento incompleto del pellet, le proteine precipitate umide che si attaccano alle punte delle pipette e al tubo originale e le particelle solide del pellet che bloccano la punta della pipetta. Un suggerimento pratico per facilitare il trasferimento del pellet è quello di rimuovere circa 0,3-0,5 mm dall’estremità della punta della pipetta con un paio di forbici, consentendo di aspirare particelle di pellet più grandi e rilasciarle nel flaconcino del guscio. Questo metodo di trasferimento è una pratica comune per l’estrazione delle proteine per tutte le analisi degli amminoacidi. Tuttavia, devono essere studiate modifiche per migliorare l’efficienza e l’accuratezza del trasferimento quantitativo del pellet nel flaconcino del guscio.

Due forme di tecniche di idrolisi possono essere impiegate per rilasciare gli amminoacidi dal loro stato legato alle proteine: idrolisi in fase liquida e idrolisi acido-vapore. L’idrolisi in fase liquida, che comporta l’aggiunta di 6 M HCl sul campione, che viene poi posto in un forno a 110 °C durante la notte, è un’alternativa all’idrolisi acido-vapore descritta nel presente protocollo. Le tecniche di estrazione che impiegano l’idrolisi in fase liquida possono richiedere ulteriori elaborazioni, come la desalinizzazione, specialmente se viene scelta la derivatizzazione dell’AQC, in quanto richiede condizioni di base per l’etichettatura⁴⁰. L’idrolisi acido-vapore evita la desalinizzazione e consente all’utente la libertà di scegliere la tecnica di derivatizzazione al momento della ricostituzione del pellet finale prima della filtrazione. Inoltre, indipendentemente dal metodo di idrolisi scelto, i campioni possono richiedere ulteriori elaborazioni, come SPE per la purificazione della matrice e la concentrazione 29,47,48, a seconda della scelta della tecnica di derivatizzazione e/o dell’analisi analitica (ad esempio^, fase inversa LC-MS/MS vs. cromatografia liquida di interazione idrofila [HILIC] LC-MS/MS ³⁷ ). La ricostituzione del pellet finale in 20 mM HCl in questo protocollo è appropriata per la derivatizzazione utilizzando i reagenti PCF⁴⁸tramite un kit di idrolisi amminoacidica disponibile in commercio³⁹ (vedi Tabella dei materiali). Sia AQC che PCF derivatizzano tutti gli amminoacidi, proteine e non proteine di origine presenti nel campione, e la selettività degli analiti è ottenuta attraverso l’uso di LC-MS/MS e la sua combinazione di corrispondenza del tempo di ritenzione e selezione accurata del quantificatore e qualificatore MRM³⁸. 

Gli attuali protocolli di idrolisi non sono ottimizzati per il rilascio di BMAA, 2,4-DAB e AEG ma per i 22 amminoacidi proteici basati sui metodi esistenti per l’idrolisi proteica 32, in cui l’incubazione per più di 18 ore provoca la degradazione e la modifica di alcuni amminoacidi, influenzando l’analisi LC-MS/MS e, quindi, le concentrazioni ottenute³². Beach et ^al.49 hanno studiato l’idrolisi nel tempo (0,5-120 ore) per ottimizzare l’idrolisi per l’analisi del BMAA e degli amminoacidi proteinogenici. Hanno scoperto che, sebbene ci fosse un rapido rilascio precoce di BMAA durante le prime 0,5 ore dell’idrolisi, i livelli di BMAA continuavano ad aumentare con l’aumentare del tempo di idrolisi, senza degradazione, anche dopo 5 giorni⁴⁹. Ci sono anche ancora diversi punti di vista e domande sulla vera natura del BMAA legato e dei suoi isomeri, con alcuni studi che suggeriscono che piuttosto che il legame BMAA 50,51 o l’errata incorporazione nelle proteine^14, l’associazione BMAA-proteina è superficiale⁵². Tuttavia, l’attuale consenso nell’analisi del BMAA “legato” richiede la fase di idrolisi convalidata e ampiamente accettata che rompe peptidi / proteine per rilasciare amminoacidi e, quindi, BMAA e i suoi isomeri.

I tassi di recupero di 20 aminoacidi proteici sono stati determinati in uno studio di Sedgwick et ^al.42 utilizzando l’estrazione TCA, con conseguente recupero di circa il 100%. Nel caso del BMAA e dei suoi isomeri da matrici algali, gli studi che confrontano l’efficienza dell’estrazione BMAA utilizzando vari solventi di estrazione hanno trovato che il 10% di TCA è il più efficiente per BMAA libero²⁷. I tassi di recupero per il BMAA legato alle proteine estratto utilizzando l’idrolisi in fase liquida sono stati stabiliti negli studi di Glover et ^al.25 e di Faassen et ^al.53, dove l’accuratezza è stata determinata da metodi di recupero a picco, con un tasso medio di recupero BMAA del 108,6% e del 70%, rispettivamente. Faassen et al. hanno descritto le procedure per gli esperimenti di recupero delle punte e hanno illustrato come il recupero differisca a seconda della fase del processo di estrazione del picco⁵³. Faassen et al. hanno inoltre determinato l’efficienza del protocollo acido-vapore qui presentato, con tassi di recupero dell’83,6% per gli isomeri BMAA prima dell’estrazione e del 68,6% per quelli picchiati prima dell’idrolisi²⁴. Questi recuperi, metodi di estrazione e analisi sono stati ulteriormente convalidati da Banack 26, con tassi di recupero del 94% -106% per BMAA in una matrice cianobatterica e una deviazione standard relativa (%RSD) tra il 5,6% e il²⁰%, soddisfacendo i criteri FDA per l’accuratezza⁵⁴. Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca inizialmente i suoi tassi di recupero e l’accuratezza prima di utilizzare questo protocollo tramite esperimenti di recupero spike. I metodi di recupero presentati in Faassen et ^al.53 e Glover et ^al.25 possono essere seguiti come guida.

Forme alternative di tecniche di idrolisi possono essere utilizzate al posto dell’idrolisi del forno notturno per un’estrazione più rapida legata alle proteine dell’analita. Ad esempio, un estrattore a microonde potrebbe ridurre significativamente il tempo di idrolisi da 24 ore a un minimo di 10 minuti^{e 55}. L’idrolisi a microonde per gli amminoacidi utilizza gli stessi principi del metodo termico convenzionale, utilizzando un vano portaoggetti per preparare e assemblare il recipiente a microonde in un ambiente privo di ossigeno e aggiungendo 6 M HCl. Una volta ermetico, il recipiente contenente il campione subisce radiazioni a microonde. L’idrolisi a microonde è stata utilizzata per estrarre amminoacidi da varie matrici campione^56,57,58; tuttavia, l’idrolisi a microonde deve ancora essere sviluppata e convalidata per l’analisi della BMAA.

In conclusione, la precipitazione proteica acquosa TCA al 10% è il metodo ottimale per estrarre aminoacidi liberi non proteici dalle matrici cianobatteriche²⁷ e l’idrolisi termica fornisce un’estrazione affidabile e riproducibile della frazione legata alle proteine. Questo protocollo per estrarre il BMAA NPAA e i suoi isomeri dai cianobatteri è convalidato e ampiamente accettato. Le direzioni future per ottimizzare ulteriormente l’estrazione di BMAA si concentreranno sulla fase di idrolisi, che viene eseguita secondo le specifiche dei 22 aminoacidi proteici. Tuttavia, il protocollo di estrazione qui presentato dovrebbe ancora essere considerato efficiente ed efficace per l’analisi del BMAA e dei suoi isomeri tramite LC-MS/MS.