Экстракция небелковых аминокислот из цианобактерий для жидкостной хроматографии-тандемного масс-спектрометрического анализа

Протокол экстракции, описанный здесь для анализа NPAA, применяется к анализу любых аминокислот в биологических образцах. Для получения руководств по выделению и культивированию цианобактериальных штаммов можно обратиться к методам, представленным в исследовании Violi et ^al.38. Первый шаг в протоколе доводит образец до точки, где может быть достигнута нормализация между образцами по отношению к сухому весу. Второй этап представляет собой лизис клеток для высвобождения аналитов и может быть выполнен с использованием множества методов, включая механические сбои/лизы, такие как зондовая обработка ультразвуком, как описано в настоящем протоколе, циклы замораживания/оттаивания, измельчение и измельчение шариков, а также немеханические нарушения, такие как ферментативный, моющий и/или химический лизис. Известно, что механическое разрушение является преимуществом по сравнению с немеханическим, поскольку оно позволяет увеличить способность образца лизироваться, позволяя внутриклеточным связям и белкам оставаться^{нетронутыми 41}, хотя матрица образца может диктовать оптимальный метод лизирования клеток.

Осаждение белка является критическим третьим этапом этого протокола при извлечении аминокислот для анализа. ТЦА является наиболее часто используемым растворителем; однако также использовались хлорная кислота, ацетон, метилтрет-бутиловый эфир (МТБЭ), метанол и/или ацетонитрил ^8,42, где каждый экстракционный растворитель предназначен для извлечения и осаждения различных субстратов. Модель, описанная здесь, извлекает NPAA BMAA и его изомеры из цианобактериальной матрицы, и, хотя был использован ряд различных растворителей, двумя наиболее распространенными являются 10% TCA в воде (водный) и 10% TCA в ацетоне. В общем, осаждение белка с TCA обычно используется для извлечения аминокислот для фракционирования свободных аминокислот из аминокислот, связанных с белком. Кроме того, экстракция TCA позволяет определить общее содержание белка, уменьшая загрязняющие вещества для свободной фракции и снижая активность протеаз с минимальной деградацией белка⁴³. Экстракция свободной фракции TCA работает путем первоначального промывания органически-растворимых веществ, оставляя после себя белки и нерастворимые соединения, такие как остатки клеточной стенки в осадке, за которым затем следует термическая гидролизная экстракция связанных с белком аминокислот (связанная фракция) с использованием сильной кислоты.

Фракционирование свободной фракции с 10% водным TCA плюс обработка ультразвуком приводит к наиболее обширному осаждению белка по сравнению с другими органическими растворителями⁴⁴ и наилучшему восстановлению аминокислот⁴². Некоторые исследования предпочитают использовать кислоту в сочетании с органическим растворителем (т.е. 10%-20% TCA в ацетоне⁴³) для осаждения большего количества молекул, включая меньшие пептиды / биомолекулы, минимизации деградации белка и уменьшения загрязняющих веществ, таких как соли⁴³. Еще одним преимуществом 10% TCA в ацетоне является его более высокая скорость высыхания при подготовке гранул к гидролизу, минимизация остатков влаги для предотвращения модификации аминокислот. Тем не менее, 10% водный TCA плюс обработка ультразвуком имеют лучшую эффективность экстракции свободных аминокислот по сравнению с 10% TCA только в ацетоне⁴⁴. Кроме того, 10% водное осаждение ТЦА имеет ограничения, такие как длительное время высыхания, неспособность осаждать все белки или небольшие пептиды/биомолекулы, и в зависимости от интересующего аналита (т.е. белков или аминокислот), требующих добавок и восстановителей для предотвращения окисления и деградации^45,46.

Этот протокол использует комбинацию 10% водного ТЦА и 10% ТЦА в ацетоне для увеличения осаждения белка, обеспечения осаждения меньших пептидов / биомолекул, обеспечения более быстрого времени сушки гранул и повышения эффективности экстракции, используя преимущества обоих свойств экстракции растворителем. Однако комбинация 10% водного ТЦА и 10% ТЦА в ацетоне может осаждать небольшие пептиды/биомолекулы в свободной фракции после того, как 10% ТЦА в ацетоновом супернатанте сочетается с водной свободной фракцией. В этом случае осадки следует перенести в связанную фракцию для гидролиза.

Вторая половина этого протокола включает высвобождение аминокислот (т.е. BMAA) из белковой гранулы посредством кислотно-парового гидролиза при повышенных температурах в бескислородной среде. Преобладающим ограничивающим фактором для стадии гидролиза является то, что подготовка к ней трудоемка и трудоемка. Ночная инкубация предотвращает быструю и эффективную по времени подготовку и анализ проб. Кроме того, количественный перенос гранулы из трубки центрифуги во флакон скорлупы (этап 3.4) является трудным процессом, который требует усердия и терпения для обеспечения точной точки нормализации до сухого веса. Возможными проблемами, с которыми может столкнуться пользователь, являются неполный перенос гранулы, влажные осажденные белки, прилипшие к наконечникам пипетки и оригинальной трубке, и твердые частицы гранулы, блокирующие наконечник пипетки. Практическим предложением для облегчения переноса гранулы является удаление около 0,3-0,5 мм с конца кончика пипетки ножницами, что позволит более крупным частицам гранул быть втянутыми и выпущенными во флакон оболочки. Этот метод переноса является обычной практикой для экстракции белка для всех аминокислотных анализов. Однако следует исследовать модификации для повышения эффективности и точности количественного переноса гранулы во флакон оболочки.

Для высвобождения аминокислот из их связанного с белком состояния могут быть использованы две формы методов гидролиза: гидролиз жидкой фазы и гидролиз паров кислоты. Жидкофазный гидролиз, который включает добавление 6 M HCl к образцу, который затем помещают в печь с температурой 110 °C на ночь, является альтернативой гидролизу паров кислоты, описанному в настоящем протоколе. Методы экстракции, использующие жидкофазный гидролиз, могут потребовать дальнейшей обработки, такой как опреснение, особенно если выбрана дериватизация AQC, поскольку она требует основных условий для маркировки⁴⁰. Кислотно-паровой гидролиз позволяет избежать опреснения и дает пользователю свободу выбора метода дериватизации при восстановлении конечной гранулы перед фильтрацией. Кроме того, независимо от выбранного метода гидролиза, образцы могут потребовать дальнейшей обработки, такой как SPE для очистки матрицы и концентрации 29,47,48, в зависимости от выбора метода дериватизации и/или аналитического анализа (например, обратная фаза LC-MS/MS против гидрофильной взаимодействия жидкостной хроматографии [HILIC] LC-MS/MS³⁷ ). Восстановление конечной гранулы в 20 мМ HCl в настоящем протоколе целесообразно для дериватизации с использованием реагентов⁴⁸ PCF через коммерчески доступный набор³⁹ для гидролиза аминокислот (см. Таблицу материалов). Как AQC, так и PCF будут дериватизировать все аминокислоты, белки и небелки в происхождении, присутствующие в образце, а селективность аналитов будет получена путем использования LC-MS/MS и его комбинации согласования времени удержания и тщательного выбора квантора и квалификатора MRM³⁸. 

Современные протоколы гидролиза оптимизированы не для высвобождения BMAA, 2,4-DAB и AEG, а для 22 белковых аминокислот, основанных на существующих методах гидролиза белка³², где инкубация в течение более 18 ч приводит к деградации и модификации определенных аминокислот, влияя на анализ LC-MS/MS и, таким образом, на полученные концентрации³². Beach et ^al.49 исследовали гидролиз с течением времени (0,5-120 ч) для оптимизации гидролиза для анализа BMAA и протеиногенных аминокислот. Они обнаружили, что, хотя в течение первых 0,5 ч гидролиза наблюдалось раннее быстрое высвобождение BMAA, уровни BMAA продолжали увеличиваться по мере увеличения времени гидролиза, без деградации, даже через 5 дней⁴⁹. Существуют также различные взгляды и вопросы об истинной природе связанного BMAA и его изомеров, причем некоторые исследования предполагают, что вместо BMAA, связывающего^50,51 или неправильного включения в белки¹⁴, BMAA-белковая ассоциация является поверхностной⁵². Тем не менее, текущий консенсус в анализе «связанного» BMAA требует проверенной и широко принятой стадии гидролиза, которая расщепляет пептиды / белки для высвобождения аминокислот и, таким образом, BMAA и его изомеров.

Скорость восстановления 20 белковых аминокислот была определена в исследовании Sedgwick et ^al.42 с использованием экстракции TCA, что привело к примерно 100% восстановлению. В случае BMAA и его изомеров из матриц водорослей исследования, сравнивающие эффективность экстракции BMAA с использованием различных экстракционных растворителей, показали, что 10% TCA является наиболее эффективным для свободного BMAA²⁷. Скорости восстановления для связанного с белком BMAA, извлеченного с использованием жидкофазного гидролиза, были установлены в исследованиях Glover et ^al.25 и Faassen et ^al.53, где точность определялась методами шипованного восстановления со средней скоростью восстановления BMAA 108,6% и 70% соответственно. Faassen et al. описали процедуры экспериментов по восстановлению шипов и проиллюстрировали, как восстановление отличается в зависимости от стадии процесса экстракции, в котором шип был сделан⁵³. Faassen et al. дополнительно определили эффективность протокола кислотных паров, представленного здесь, со скоростью извлечения 83,6% для изомеров BMAA, полученных до экстракции, и 68,6% для тех, которые были повышены до гидролиза²⁴. Эти извлечения, методы экстракции и анализы были дополнительно подтверждены Banack²⁶, с коэффициентом восстановления 94%-106% для BMAA в цианобактериальной матрице и %относительным стандартным отклонением (%RSD) между 5,6% и 20%, что соответствует критериям точности FDA⁵⁴. Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория первоначально установила свои скорости и точность восстановления, прежде чем использовать этот протокол с помощью экспериментов по восстановлению шипов. Методы восстановления, представленные в Faassen et ^al.53 и Glover et ^{al.25, могут использоваться} в качестве руководства.

Альтернативные формы методов гидролиза могут быть использованы вместо ночного гидролиза в печи для более быстрой экстракции анализируемого вещества, связанного с белком. Например, микроволновая экстрактор может значительно сократить время гидролиза с 24 ч до 10 мин⁵⁵. Микроволновый гидролиз аминокислот использует те же принципы, что и обычный термический метод, используя перчаточный ящик для подготовки и сборки микроволнового сосуда в бескислородной среде и добавляя 6 M HCl. После герметизации сосуд, содержащий образец, подвергается микроволновому излучению. Микроволновый гидролиз был использован для извлечения аминокислот из различных матриц образцов 56,57,58; однако микроволновый гидролиз еще предстоит разработать и проверить для анализа BMAA.

В заключение, 10% водное осаждение белка TCA является оптимальным методом извлечения свободных небелковых аминокислот из цианобактериальных матриц²⁷, а термический гидролиз обеспечивает надежную и воспроизводимую экстракцию связанной с белком фракции. Этот протокол для извлечения NPAA BMAA и его изомеров из цианобактерий валидирован и широко принят. Будущие направления по дальнейшей оптимизации экстракции BMAA будут сосредоточены на стадии гидролиза, которая выполняется в соответствии со спецификациями 22 белковых аминокислот. Тем не менее, представленный здесь протокол извлечения по-прежнему следует считать эффективным и действенным для анализа BMAA и его изомеров через LC-MS/ MS.