מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיצוי של חומצות אמינו שאינן חלבוניות ממטריצות ביולוגיות באמצעות משקעי חלבון חומצה טריכלורואצטית (TCA) והידרוליזה חומצית לפני ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם.
Abstract
חומצות אמינו שאינן חלבוניות (NPAAs) הן קבוצה גדולה של חומצות אמינו (AAs) שאינן מקודדות גנטית לתרגום לחלבונים. הניתוח של NPAAs יכול לספק מידע חיוני על ספיגה ו/או תפקוד של תאים, מסלולים מטבוליים ורעילות פוטנציאלית. β-מתילאמינו-L-אלנין (BMAA) הוא NPAA נוירוטוקסי המיוצר על ידי מיני אצות שונים ונקשר לסיכון מוגבר למחלות נוירודגנרטיביות, מה שהוביל להתעניינות מחקרית משמעותית. ישנן דרכים רבות לחלץ AAs לניתוח, כאשר ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית היא הנפוצה ביותר, ודורשת משקעי חלבון ואחריה הידרוליזה חומצית של גלולת החלבון. מחקרים על נוכחות של BMAA במיני אצות מספקים תוצאות סותרות, כאשר השימוש בהכנה/מיצוי וניתוח של דגימות לא מוערכים הוא הגורם העיקרי. כמו רוב ה-NPAA, משקעי חלבון ב-10% TCA מימי והידרוליזה עם HCl מתפוצץ הם צורת המיצוי המתאימה ביותר ל-BMAA ולאיזומרים שלו אמינואתיל-גליצין (AEG) ו-2,4-חומצה דיאמינובוטירית (2,4-DAB). הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים בשיטת מיצוי NPAA מאומתת המשמשת בדרך כלל במעבדות מחקר והוראה.
Introduction
חומצות אמינו הן תרכובות כימיות המכילות לפחות אמין אחד וקבוצה תפקודית קרבוקסילית. חומצות אמינו מסוימות מכילות גם קבוצת imino, קבוצת חומצה פונקציונלית שאינה קרבוקסילית; לחומצות אמינו אחרות יש קבוצות אמין שאינן מחוברות לקבוצת α-פחמן1. ישנן מעל 500 חומצות אמינו2, 22 מהן ידועות כחומצות אמינו חלבוניות המשמשות לקידוד גנטי בסינתזת חלבונים ריבוזומליים3. 22 חומצות אמינו אלה ניתנות לחלוקה נוספת לחיוניות ולא חיוניות. חומצות אמינו חיוניות נחוצות לאורגניזם כדי לתפקד כראוי וניתן לרכוש אותן רק על ידי מקורות חיצוניים. חומצות אמינו לא חיוניות ניתן לסנתז בתוך האורגניזם. הסיווג של 22 חומצות האמינו לחיוניות/לא חיוניות הוא ייחודי למינים בודדים. כל חומצות האמינו האחרות הן חומצות אמינו שאינן חלבוניות (NPAA) שאינן מקודדות לסינתזת חלבונים. חומצות אמינו, בין אם הן חלבוניות או שאינן חלבון, יכולות גם הן למלא תפקיד איתות בתוך אורגניזם ולפעול כמתווכות מטבוליות4. בשל תפקידיהם החשובים והמשתנים, רמות חומצות האמינו יכולות לספק תובנה לגבי מצב האורגניזם, תפקודו, מסלולי חילוף החומרים וכו’. ישנם שני מנגנונים עיקריים שבאמצעותם ניתן לשלב חומצות אמינו בשרשרת פוליפפטידים: סינתזת חלבונים ריבוזומלית, המנצלת את 22 חומצות האמינו בקידוד, וסינתזה פפטידית לא ריבוזומלית, אשר, לצד חומצות אמינו חלבוניות, מאפשרת שימוש בחלק מה- NPAAs בסינתזה. NPAAs מסוימים יכולים לחקות חומצות אמינו חלבוניות, מה שעלול להוביל לשילוב שגוי שלהם בפפטידים ובחלבונים. המיסאינקורפורציה גורמת לקיפול שגוי של חלבונים, אשר, בתורו, יש השפעות מזיקות5, כגון misincorporation של NPAA L-3,4 dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) במקום טירוזין, השפעה שלילית על תפקוד התאים ובריאות 6,7. מקור נוסף של NPAAs משולבים הוא באמצעות שינוי לאחר תרגום (PTM) של שאריות חומצות אמינו. שאריות חומצות אמינו משתנות מסיבות שונות, כולל שינויים בקונפורמציה של פפטידים או חלבונים, יציבות ופונקציונליות. לאחר הידרוליזה של חלבון או פפטידים המכילים PTM, שאריות חומצות אמינו מותאמות אלה משתחררות לצורת NPAAהחופשית שלהם 8,9.
NPAA β-מתילאמינו-L-אלנין (BMAA) המיוצר על ידי ציאנובקטריה, דיאטום ודינופלגלטים10 הוא חשד לנוירוטוקסין המעורב כגורם תורם למחלות נוירודגנרטיביות שונות כגון טרשת אמיוטרופית צידית / קומפלקס פרקינסון-דמנציה (ALS-PDC)11,12, טרשת אמיוטרופית צידית ומחלת אלצהיימר 13 . ההשערה היא ש-BMAA משולב בטעות בשרשרת החלבונים הפוליפפטידים במקום L-serine14 ו/או חומצות אמינו חלבוניות אחרות. שילוב שגוי של BMAA יכול להוביל לקיפול שגוי של חלבונים, וכתוצאה מכך לתצהיר של אגרגטים של חלבונים בנוירונים14. בעשור האחרון, העניין ב- BMAA גדל באופן משמעותי. מגוון רחב של מינים ציאנובקטריאליים מסביבות מים מתוקים, ימיים ומליחים התגלו כמייצרים BMAA15, מה שמוביל לתפוצתם הנרחבת למערכות אקולוגיות שונות16,17. בנוסף, הוכח כי BMAA מתמזג דרך שרשרת המזון אל מארג המזון האנושי18,19. בשל ההשפעות הבריאותיות הפוטנציאליות, חוסר ההבנה וחוסר ההתאמה של רעילות BMAA, חובה להמשיך במחקר נוסף עד שהרעילות של BMAA תובן בסופו של דבר או ש-BMAA ייחשב בטוח20,21.
ניתן לחלק את ניתוח חומצות האמינו בדגימות ביולוגיות לארבעה שלבים עיקריים: הכנת הדגימה, גזירת חומצות אמינו, הפרדה וזיהוי, וזיהוי וכימות. ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית (LC-MS/MS) היא שיטת הניתוח המועדפת מכיוון שהיא מספקת הפרדה וניתוח ממוקדים וניתנים לשחזור של חומצות אמינו.
טכניקות הכנת דגימות לניתוח דגימות ציאנובקטריאליות ואצות אחרות כוללות בעיקר שיטת מיצוי של חומצות אמינו בצורתן החופשית והקשורה לחלבון. במהלך השנים, שיטות המיצוי נשארו עקביות יחסית עם אלמנטים נפוצים, כולל השממת הדגימה כדי להפריד את חומצות האמינו החופשיות מצורתן הכבולה, ולאחר מכן משקעי חלבון ושחרור חומצות אמינו קשורות באמצעות הידרוליזה עם חומצה הידרוכלורית (HCl) בטמפרטורות גבוהות22 . צורת מיצוי זו עברה אופטימיזציה לחומצות אמינו חלבוניות ומשמשת ל-NPAA. עם זאת, הזיהוי והכימות של BMAA והאיזומרים שלו (איור 1), אמינואתילגליצין (AEG) וחומצה דיאמינו-בוטירית 2,4-(2,4-DAB), באותו מין של ציאנובקטריה, הראו תוצאות לא עקביות בספרות, כאשר הסבר אפשרי טמון בהבדלים בתנאי הגידול ו/או בזן האצות המייצרות כמויות משתנות או ללא צריכה של BMAA23 . נטען כי הסבר סביר יותר לחוסר העקביות בזיהוי וכימות של BMAA והאיזומרים שלו נובע מפרוטוקולים ניסיוניים לא מוערכים, שימוש במגוון רחב של טכניקות אנליטיות, ופירוט ניסיוני לא מספיק בשיטות המדווחות16,24 המוביל לנתונים בין-מעבדתיים בלתי ניתנים לשחזור. עם זאת, Glover et al.25 ו- Banack 26 פיתחו לאחרונה ותקפו טכניקה אנליטית לזיהוי וכימות של BMAA והאיזומרים שלה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC)-MS/MS בהתאם לאיגוד הבינלאומי של כימאים אנליטיים (AOAC), הפרמקופיאה האמריקאית והנחיות ה- FDA הדרושות לאימות מעבדה אחת.
ניסויי תיקוף אלה התמקדו בהפרדה ובזיהוי של BMAA והאיזומרים שלו ולא התייחסו לחוסר העקביות בפרוטוקולים להכנת דגימות. Lage et al.27 השוו את הביצועים של שלוש שיטות מיצוי נפוצות לכימות BMAA והאיזומרים שלו בדגימות ציאנובקטריאליות באמצעות LC-MS/MS: מיצוי פאזה מוצקה (SPE) של חומצות אמינו חופשיות28,29; שיטת מיצוי חלבונים הכוללת מיצוי מתנול ומשקעי אצטון30; ושיטת המיצוי הנפוצה ביותר עבור BMAA, משקעי חלבון עם חומצה טריכלורואצטית (TCA)31. הם הגיעו למסקנה כי משקעי החלבון TCA הם הפרוטוקול האופטימלי, והניב ריכוזי BMAA גבוהים יותר בדגימות הבדיקה בהשוואה לשיטות המיצוי האחרות. המחקר שלהם אימת מיצוי TCA עם נגזרת של BMAA באמצעות 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוקסיסוקינימידיל קרבמט (AQC) במטריצת ציאנובקטריה, וסיפק מדריך מבוסס להשגת נתוני BMAA אמינים וניתנים לשחזור. מיצוי חומצות אמינו TCA הוא טכניקת הכנת דגימות מקובלת ונפוצה שניתן ליישם גם על מטריצות אחרות. עם זאת, היציבות של חומצת האמינו במהלך הידרוליזה צריך להיחשב כדי למנוע השפלה או חמצון, אשר ניתן להתגבר עם השימוש של משנים כימיים וחומרים מחזרים32. מיצוי TCA משמש באופן שגרתי ונלמד לתלמידי מחקר חדשים, ולמרות שהפרוטוקול מדווח בהרחבה, סיוע חזותי ביישום שיטה זו הוא משאב יקר ערך, המבטיח ביצוע תקין ועקבי.
כרומטוגרפיה בפאזה הפוכה משמשת בדרך כלל להפרדת חומצות אמינו, הדורשת שלב נגזרת לפני ניתוחים. הנגזרת של חומצות אמינו כגון BMAA מאפשרת שימור כרומטוגרפי ויכולה להגדיל את הרזולוציה בין איזומרים. זה גם מגדיל את המסה המולקולרית ומשפר את היינון בספקטרומטר המסה. מספר ריאגנטים נגזרים שימשו לניתוח חומצות אמינו באמצעות LC-MS/MS, כולל פרופיל כלורופורמט (PCF)33, 6-אמינוקווינוליל-N-הידרוסיסוקסינימידיל קרבמט (AQC)27, 9-פלואורנילמתיל כלורופורמט (FMOC)34, ודנסיל כלוריד (DC)35. עם זאת, הטכניקות המאומתות היחידות לניתוח BMAA השתמשו ב- PCF 36 או ב- AQC24,26,37 כמגיב הנגזר שלהם.
היקף פרוטוקול זה מתמקד במיצוי TCA של NPAAs ממטריצות ציאנובקטריאליות. זוהי שיטה עתירת עבודה שנעשה בה שימוש שגרתי ונלמדת במעבדות מחקר אקדמיות ותעשייתיות המבוססות על כתבי יד שעשויים להיות קצרים בפרטים; לכן, פרוטוקול זה מספק פרטים על ההליך והטכניקות הכרוכות בהכנת דגימות לניתוח של BMAA חופשי ומאוגד כחומצת אמינו מודל.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המיצוי המתואר כאן לניתוח NPAAs חל על ניתוח חומצות אמינו בדגימות ביולוגיות. עבור מדריכים על בידוד וגידול זנים ציאנובקטריאליים, ניתן להתייחס לשיטות שהוצגו במחקר על ידי Violi et al.38. השלב הראשון בפרוטוקול לוקח את הדגימה לנקודה שבה ניתן להשיג נורמליזציה בין דגימות כנגד המשקל היבש. השלב השני הוא תזה תאית לשחרור האנליטים וניתן לבצעה באמצעות מגוון טכניקות, כולל שיבושים מכניים/ליזות כגון סוניקציית בדיקה כמתואר בפרוטוקול זה, מחזורי הקפאה/הפשרה, שחיקה וכרסום חרוזים, ושיבושים לא מכניים כגון אנזימטי, דטרגנט ו/או תזה כימית. שיבוש מכני ידוע כיתרון על פני לא מכני מכיוון שהוא מאפשר קיבולת גדולה יותר של הדגימה לליזה תוך מתן אפשרות לקשרים ולחלבונים התוך-תאיים להישאר שלמים41, אם כי מטריצת הדגימה עשויה להכתיב את השיטה האופטימלית לליזה של התא.
משקעי חלבון הם השלב השלישי הקריטי של פרוטוקול זה בעת מיצוי חומצות אמינו לניתוח. TCA הוא הממס הנפוץ ביותר; עם זאת, נעשה שימוש גם בחומצה פרכלורית, אצטון, מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE), מתנול ו/או אצטוניטריל 8,42, כאשר כל ממס מיצוי נועד לחלץ ולזרז מצעים שונים. המודל המתואר כאן מחלץ את ה-NPAA BMAA ואת האיזומרים שלו ממטריצה ציאנובקטריאלית, ולמרות שנעשה שימוש במגוון ממסים שונים, שני הממסים הנפוצים ביותר הם 10% TCA במים (מימיים) ו-10% TCA באצטון. באופן כללי, משקעי חלבון עם TCA משמשים בדרך כלל למיצוי חומצות אמינו כדי לפרק חומצות אמינו חופשיות מחומצות האמינו הקשורות לחלבון. בנוסף, מיצוי TCA מאפשר לקבוע את תכולת החלבון הכוללת, להפחית מזהמים עבור החלק החופשי, ולהפחית את הפעילות של פרוטאזות עם השפלה מינימלית של חלבון43. מיצוי ה-TCA של השבר החופשי פועל על ידי שטיפה ראשונית של חומרים מסיסים אורגניים, תוך השארת חלבונים ותרכובות בלתי מסיסות כגון שרידי דופן התא במשקע, ולאחר מכן מיצוי הידרוליזה תרמית של חומצות האמינו הקשורות לחלבון (שבר קשור) באמצעות חומצה חזקה.
הפיצול של החלק החופשי עם 10% TCA מימי בתוספת סוניקציה מייצר את משקעי החלבון הנרחבים ביותר בהשוואה לממיסים אורגניים אחרים44 וחומצת האמינו הטובה ביותר מתאוששת42. מחקרים מסוימים בוחרים להשתמש בחומצה בשילוב עם ממס אורגני (כלומר, 10%-20% TCA באצטון 43) כדי לזרז יותר מולקולות, כולל פפטידים/ביומולקולות קטנות יותר, למזער את פירוק החלבון ולהפחית מזהמים כגון מלחים43. יתרון נוסף של 10% TCA באצטון הוא קצב הייבוש המהיר יותר שלו בהכנת הכדור להידרוליזה, תוך מזעור שאריות הלחות למניעת שינוי חומצות אמינו. עם זאת, 10% TCA מימי בתוספת סוניקציה הם בעלי יעילות מיצוי טובה יותר של חומצות אמינו חופשיות בהשוואה ל-10% TCA באצטון44 בלבד. בנוסף, למשקעי TCA מימיים של 10% יש מגבלות כגון זמן ייבוש ארוך, אי יכולת לזרז את כל החלבונים או פפטידים/ביומולקולות קטנות, ובהתאם לאנליטיט המעניין (כלומר, חלבונים או חומצות אמינו), הדורשים תוספים וחומרים מחזרים כדי למנוע חמצון ופירוק45,46.
פרוטוקול זה משתמש בשילוב של 10% TCA מימי ו-10% TCA באצטון כדי להגדיל את משקעי החלבון, להבטיח זירוז פפטידים/ביומולקולות קטנות יותר, לאפשר זמני ייבוש מהירים יותר של גלולות ולהגביר את יעילות המיצוי, תוך ניצול שתי תכונות מיצוי הממסים. עם זאת, השילוב של 10% TCA מימי ו-10% TCA באצטון יכול לזרז פפטידים/ביומולקולות קטנות בשבר החופשי לאחר ש-10% TCA בסופרנטנט אצטון משולב עם השבר החופשי המיימי. במקרה זה, יש להעביר את המשקעים לחלק המאוגד להידרוליזה.
המחצית השנייה של פרוטוקול זה כוללת שחרור של חומצות אמינו (כלומר, BMAA) מכדור החלבון באמצעות הידרוליזה של אדי חומצה בטמפרטורות גבוהות בסביבה נטולת חמצן. הגורם המגביל בעיקר לשלב ההידרוליזה הוא שזה גוזל זמן ומייגע להכין. הדגירה למשך הלילה מונעת הכנה וניתוח מהירים וחסכוניים בזמן של הדגימה. בנוסף, ההעברה הכמותית של הכדור מצינור צנטריפוגה לבקבוקון פגז (שלב 3.4) היא תהליך מפרך הדורש חריצות וסבלנות כדי להבטיח נקודה מדויקת של נורמליזציה למשקל היבש. בעיות אפשריות שהמשתמש עלול להתמודד איתן הן העברה לא שלמה של הכדור, חלבונים רטובים הנדבקים לקצות הפיפטה ולצינור המקורי, וחלקיקים מוצקים של הכדור החוסמים את קצה הפיפטה. הצעה מעשית בסיוע להעברה קלה יותר של הכדור היא להסיר כ-0.3-0.5 מ”מ מקצה קצה הפיפטה בעזרת זוג מספריים, מה שיאפשר למשוך חלקיקי גלולה גדולים יותר ולשחררם לתוך בקבוקון הקליפה. שיטת העברה זו מקובלת למיצוי חלבונים עבור כל ניתוחי חומצות האמינו. עם זאת, יש לחקור שינויים לשיפור היעילות והדיוק של העברה כמותית של הכדור לתוך בקבוקון הקליפה.
ניתן להשתמש בשתי צורות של טכניקות הידרוליזה כדי לשחרר חומצות אמינו ממצבן הקשור לחלבון: הידרוליזה בפאזה נוזלית והידרוליזה של אדי חומצה. הידרוליזה בפאזה נוזלית, הכוללת תוספת של 6 M HCl על הדגימה, אשר ממוקמת לאחר מכן בתנור של 110 מעלות צלזיוס למשך הלילה, היא חלופה להידרוליזה של אדי חומצה המתוארת בפרוטוקול זה. טכניקות מיצוי המשתמשות בהידרוליזה בשלב נוזלי עשויות לדרוש עיבוד נוסף, כגון התפלה, במיוחד אם נבחרה נגזרת AQC, מכיוון שהיא דורשת תנאים בסיסיים לתיוג40. הידרוליזה של אדי חומצה מונעת התפלה ומאפשרת למשתמש את החופש לבחור בטכניקת הנגזרת עם שחזור הכדור הסופי לפני הסינון. יתר על כן, ללא תלות בשיטת ההידרוליזה שנבחרה, הדגימות עשויות לדרוש עיבוד נוסף, כגון SPE לטיהור מטריצה וריכוז 29,47,48, בהתאם לבחירת טכניקת הנגזרת ו/או ניתוח אנליטי (למשל, LC-MS/MS בפאזה הפוכה לעומת כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית [HILIC] LC-MS/MS 37 ). שחזור הכדור הסופי ב-20 mM HCl בפרוטוקול זה מתאים לגזירה באמצעות ריאגנטים PCF48באמצעות ערכת הידרוליזה של חומצת אמינו זמינה מסחרית39 (ראו טבלת חומרים). הן AQC והן PCF יפיקו את כל חומצות האמינו, החלבון והלא-חלבונים שמקורם בדגימה, והסלקטיביות של האנליטים מתקבלת באמצעות שימוש ב-LC-MS/MS והשילוב של התאמת זמן שמירה ובחירה זהירה של ה-MRMs38 הקוונטיפייר והמאשר.
פרוטוקולי ההידרוליזה הנוכחיים אינם מותאמים לשחרור BMAA, 2,4-DAB ו-AEG אלא ל-22 חומצות אמינו חלבוניות המבוססות על שיטות קיימות להידרוליזה של חלבונים 32, שבהן דגירה למשך יותר מ-18 שעות גורמת לפירוק ושינוי של חומצות אמינו מסוימות, המשפיעה על ניתוח LC-MS/MS, ולכן על הריכוזים המתקבלים32. Beach et al.49 חקרו הידרוליזה לאורך זמן (0.5-120 שעות) כדי לייעל הידרוליזה לניתוח BMAA וחומצות אמינו פרוטאינוגניות. הם מצאו שלמרות שהיה שחרור מהיר מוקדם של BMAA במהלך 0.5 השעות הראשונות של ההידרוליזה, רמות ה-BMAA המשיכו לעלות ככל שזמן ההידרוליזה עלה, ללא השפלה, גם לאחר 5 ימים49. ישנן גם השקפות ושאלות שונות לגבי האופי האמיתי של BMAA קשור והאיזומרים שלו, כאשר כמה מחקרים מציעים כי במקום BMAA קשר 50,51 או שילוב שגוי לתוך חלבונים14, BMAA-חלבון האגודה היא שטחית52. עם זאת, הקונצנזוס הנוכחי בניתוח של BMAA “כרוך” דורש את שלב ההידרוליזה המאומת והמקובל שמפרק פפטידים/חלבונים כדי לשחרר חומצות אמינו, ולכן, BMAA והאיזומרים שלו.
שיעורי ההתאוששות של 20 חומצות אמינו חלבוניות נקבעו במחקר של Sedgwick et al.42 באמצעות מיצוי TCA, וכתוצאה מכך כ-100% התאוששות. במקרה של BMAA והאיזומרים שלו ממטריצות אצות, מחקרים שהשוו את היעילות של מיצוי BMAA באמצעות ממיסים מיצוי שונים מצאו כי 10% TCA הוא היעיל ביותר עבור BMAA27 בחינם. שיעורי ההתאוששות של BMAA הקשור לחלבון שחולצו באמצעות הידרוליזה בפאזה נוזלית נקבעו במחקרים של Glover et al.25 ועל ידי Faassen et al.53, שם הדיוק נקבע על ידי שיטות התאוששות מחודדות, עם שיעור התאוששות BMAA ממוצע של 108.6% ו-70%, בהתאמה. Faassen et al. תיארו נהלים לניסויים בהתאוששות ספייק והדגימו כיצד ההתאוששות שונה בהתאם לשלב תהליך החילוץ של הספייקנעשה 53. Faassen et al. קבעו בנוסף את היעילות של פרוטוקול אדי החומצה שהוצג כאן, עם שיעורי התאוששות של 83.6% עבור איזומרים BMAA שעלו לפני מיצוי ו-68.6% עבור אלה שזינקו לפני הידרוליזה24. שחזורים, שיטות מיצוי וניתוחים אלה אומתו עוד יותר על ידי Banack 26, עם שיעורי התאוששות של 94%-106% עבור BMAA במטריצה ציאנובקטריאלית וסטיית תקן יחסית (%RSD) בין 5.6%ל-20%, העומדים בקריטריונים של ה-FDA לדיוק54. מומלץ שכל מעבדה תקבע תחילה את שיעורי ההתאוששות והדיוק שלה לפני שתשתמש בפרוטוקול זה באמצעות ניסויי התאוששות ספייק. ניתן לעקוב אחר שיטות השחזור המוצגות ב- Faassen et al.53 ו- Glover et al.25 כמדריך.
ניתן להשתמש בצורות חלופיות של טכניקות הידרוליזה במקום הידרוליזה בתנור לילה למיצוי מהיר יותר של האנליט הקשור לחלבון. לדוגמה, מחלץ מיקרוגל יכול להפחית באופן משמעותי את זמן ההידרוליזה מ-24 שעות ל-10 דקות55 בלבד. הידרוליזה במיקרוגל לחומצות אמינו משתמשת באותם עקרונות כמו השיטה התרמית הקונבנציונלית, באמצעות תא כפפות להכנת והרכבת כלי המיקרוגל בסביבה נטולת חמצן והוספת 6 M HCl. לאחר אטום לאוויר, כלי המכיל את הדגימה עובר קרינת מיקרוגל. הידרוליזה במיקרוגל שימשה לחילוץ חומצות אמינו ממטריצות דגימה שונות56,57,58; עם זאת, הידרוליזה של מיקרוגל טרם פותחה ואומתה לניתוח BMAA.
לסיכום, 10% משקעי חלבון TCA מימיים הם השיטה האופטימלית לחילוץ חומצות אמינו חופשיות שאינן חלבוניות ממטריצות ציאנובקטריאליות27, והידרוליזה תרמית מספקת מיצוי אמין וניתן לשחזור של החלק הקשור לחלבון. פרוטוקול זה לחילוץ NPAA BMAA והאיזומרים שלו מציאנובקטריה מאומת ומקובל. כיוונים עתידיים לייעול נוסף של מיצוי BMAA יתמקדו בשלב ההידרוליזה, המתבצע על פי המפרטים של 22 חומצות האמינו החלבון. עם זאת, פרוטוקול החילוץ המוצג כאן עדיין צריך להיחשב יעיל ואפקטיבי לניתוח BMAA והאיזומרים שלו באמצעות LC-MS/MS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.P.B., K.J.R., ו-S.M.M. נתמכים על ידי קרן איאן פוטר, ו-J.P.V. זוכה בתוכנית הכשרה למחקר של ממשלת אוסטרליה, Stipend.
Materials
| 1 mL glass shell vials | SHIMADZU | REST-24663 | |
| 10% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA | ||
| 100% TCA solution | Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O) | ||
| 1000 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z683809 | |
| 13.3% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA | ||
| 2 mL tubes | MERCK | BR780546-500EA | |
| 20 mM HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
| 20-200 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z740441 | |
| 6 M HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
| 70% ethanol | Supelco | 1.11727 | Dilute 70:1 Ethanol:water |
| -80 °C Freezer | Martin CHRIST | 102142 | Alpha 2-4 Ldplus |
| AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit | Waters | 186003836 | |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | 34967-2.5L | |
| Analytical Scale Balance | |||
| Centrifugal evaporator | Thermo Scientific | 13442549 | DNA120-115 SpeedVac Concentrator |
| Centrifuge | MERCK | EP022620100-1EA | |
| D5-2,4-DAB standard | CDN Isotopes | D-7568 | |
| Drying Oven | |||
| Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit | Phenomenex | CEO-8492 | |
| Falcon tube holder | |||
| Falcon Tubes | MERCK | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes |
| Filter Tubes | Sigma-Aldrich | CLS8161-100EA | Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm) |
| Glass engraver | |||
| Hydrolysis vial & Lid | Eldex Laboratories/Waters | WAT007568 & WAT007569 | |
| Ice and container | |||
| Lint-free paper wipe | Kimwipes/Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| Milli-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Nitrogen tap with hose | |||
| P1000 Micropipette | MERCK | EP3123000063 | |
| P1000 pipette tips | MERCK | Z740127 | |
| P200 Micropipette | MERCK | EP3123000055-1EA | |
| P200 pipette tips | MERCK | Z740125 | |
| Parafilm | MERCK | P7793 | Sealing film |
| PPE – noise cancelling headphones | |||
| PPE – oven gloves | |||
| Probe sonicator | QSONICA Sonicators | Q125 Sonicator | Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones) |
| Sample transfer spatula | |||
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399-1KG | |
| Tweezers | |||
| Vacuum Pump with hose |
References
- Larsen, P. O., Miflin, B. J. Physical and Chemical Properties of Amino Acids. Amino Acids and Derivatives. , 225-269 (1980).
- Wagner, I., Musso, H. New naturally occurring amino acids. Angewandte International Edition in English. 22 (11), 816-828 (1983).
- Reeds, P. J. Dispensable and indispensable amino acids for humans. The Journal of Nutrition. 130 (7), 1835-1840 (2000).
- Bhagavan, N. V., Ha, C. -. E., Bhagavan, N. V., Ha, C. -. E. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry (Second Edition). , 21-29 (2015).
- Rubenstein, E. Misincorporation of the proline analog azetidine-2-carboxylic acid in the pathogenesis of multiple sclerosis: A hypothesis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67 (11), 1035-1040 (2008).
- Chan, S., Dunlop, R., Rowe, A., Double, K., Rodgers, K. l-DOPA is incorporated into brain proteins of patients treated for Parkinson’s disease, inducing toxicity in human neuroblastoma cells in vitro. Experimental Neurology. 238 (1), 29-37 (2012).
- Rodgers, K. J., Hume, P. M., Morris, J. G., Dean, R. T. Evidence for L-dopa incorporation into cell proteins in patients treated with levodopa. Journal of Neurochemistry. 98 (4), 1061-1067 (2006).
- Violi, J. P., Bishop, D. P., Padula, M. P., Steele, J. R., Rodgers, K. J. Considerations for amino acid analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 131, 116018 (2020).
- Hashiguchi, A., Komatsu, S., Shukla, A. K. Posttranslational Modifications and Plant-Environment Interaction. Methods in Enzymology., Volume 586. , 97-113 (2017).
- Berntzon, L., Ronnevi, L. O., Bergman, B., Eriksson, J. Detection of BMAA in the human central nervous system. Neuroscience. 292, 137-147 (2015).
- Cox, P. A., Banack, S. A., Murch, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13380-13383 (2003).
- Cox, P. A., et al. Cyanobacteria and BMAA exposure from desert dust: A possible link to sporadic ALS among Gulf War veterans. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 109-117 (2009).
- Pablo, J., et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer’s disease. Acta Neurologica Scandinavica. 120 (4), 216-225 (2009).
- Dunlop, R. A., Cox, P. A., Banack, S. A., Rodgers, K. J. The non-protein amino acid BMAA is misincorporated into human proteins in place of l-serine causing protein misfolding and aggregation. PLoS One. 8 (9), 75376 (2013).
- Cox, P. A., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (14), 5074-5078 (2005).
- Faassen, E. J. Presence of the neurotoxin BMAA in aquatic ecosystems: What do we really know. Toxins. 6 (3), 1109-1138 (2014).
- Al-Sammak, M. A., Hoagland, K. D., Cassada, D., Snow, D. D. Co-occurrence of the cyanotoxins BMAA, DABA and anatoxin-a in Nebraska reservoirs, fish, and aquatic plants. Toxins. 6 (2), 488-508 (2014).
- Wang, C., et al. Food web biomagnification of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine in a diatom-dominated marine ecosystem in China. Journal of Hazardous Materials. 404, 124217 (2021).
- Banack, S. A., Johnson, H. E., Cheng, R., Cox, P. A. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacterium). Marine Drugs. 5 (4), 180-196 (2007).
- Jiang, L., Johnston, E., Åberg, K. M., Nilsson, U., Ilag, L. L. Strategy for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (4), 1283-1292 (2013).
- Jonasson, S., Eriksson, J., Berntzon, L., Rasmussen, U., Bergman, B. A novel cyanobacterial toxin (BMAA) with potential neurodegenerative effects. Plant Biotechnology. 25 (3), 227-232 (2008).
- Cohen, S. Analytical techniques for the detection of α-amino-β-methylaminopropionic acid. Analyst. 137 (9), 1991-2005 (2012).
- Main, B. J., Rodgers, K. J. Assessing the combined toxicity of BMAA and its isomers 2,4-DAB and AEG in vitro using human neuroblastoma cells. Neurotoxicity Research. 33 (1), 33-42 (2018).
- Faassen, E. J., Gillissen, F., Lürling, M. A comparative study on three analytical methods for the determination of the neurotoxin BMAA in cyanobacteria. PLoS One. 7 (5), 36667 (2012).
- Glover, W. B., Baker, T. C., Murch, S. J., Brown, P. N. Determination of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2-aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobutyric acid in food products containing cyanobacteria by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry: Single-laboratory validation. Journal of AOAC International. 98 (6), 1559-1565 (2015).
- Banack, S. A. Second laboratory validation of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobuytric acid by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Neurotoxicity Research. 39 (1), 107-116 (2021).
- Lage, S., et al. BMAA extraction of cyanobacteria samples: Which method to choose. Environmental Science and Pollution Research. 23 (1), 338-350 (2016).
- Jonasson, S., et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquatic ecosystem suggests pathways for human exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9252-9257 (2010).
- Spáčil, Z., et al. Analytical protocol for identification of BMAA and DAB in biological samples. Analyst. 135 (1), 127-132 (2010).
- Jiang, L., et al. Diatoms: A novel source for the neurotoxin BMAA in aquatic environments. PLOS One. 9 (1), 84578 (2014).
- Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A., Steele, J. C., Sacks, O. W. Occurrence of β-methylamino-l-alanine (BMAA) in ALS/PDC patients from Guam. Acta Neurologica Scandinavica. 110 (4), 267-269 (2004).
- Davidson, I., Smith, B. J. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Protein Sequencing Protocols. , 111-122 (2003).
- Esterhuizen-Londt, M., Downing, S., Downing, T. Improved sensitivity using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for detection of propyl chloroformate derivatised -N-methylamino-L-alanine (BMAA) in cyanobacteria. Water SA. 37 (2), 133-138 (2011).
- Kisby, G. E., Roy, D. N., Spencer, P. S. Determination of β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in plant (Cycas circinalis L.) and animal tissue by precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Neuroscience Methods. 26 (1), 45-54 (1988).
- Lampinen Salomonsson, M., Hansson, A., Bondesson, U. Development and in-house validation of a method for quantification of BMAA in mussels using dansyl chloride derivatization and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (18), 4865-4874 (2013).
- Main, B. J., et al. Detection of the suspected neurotoxin β-methylamino-l-alanine (BMAA) in cyanobacterial blooms from multiple water bodies in Eastern Australia. Harmful Algae. 74, 10-18 (2018).
- Combes, A., et al. Validation of the analytical procedure for the determination of the neurotoxin β-N-methylamino-l-alanine in complex environmental samples. Analytica Chimica Acta. 771, 42-49 (2013).
- Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Colville, A., Main, B. J., Rodgers, K. J. Prevalence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) and its isomers in freshwater cyanobacteria isolated from eastern Australia. Ecotoxicology and Environmental Safety. 172, 72-81 (2019).
- AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit Care and. Waters Available from: https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=10008559 (2014)
- D’Hondt, E., Gonzalez-Fernandez, C., Munoz, R., et al. Cell Disruption Technologies. Microalgae-Based Biofuels and Bioproducts. , 133-154 (2017).
- Sedgwick, G. W., Fenton, T. W., Thompson, J. R. Effect of protein precipitating agents on the recovery of plasma free amino acids. Canadian Journal of Animal Science. 71 (3), 953-957 (1991).
- Niu, L., et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLOS One. 13 (12), 0202238 (2018).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
- Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
- Novák, P., Havlíček, V., Ciborowski, P., Silberring, J. Protein Extraction and Preparation. Proteomic Profiling and Analytical Chemistry (Second Edition). , 51-62 (2016).
- Li, A., et al. Elucidation of matrix effects and performance of solid-phase extraction for LC-MS/MS analysis of beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) neurotoxins in cyanobacteria. Analyst. 137 (5), 1210-1219 (2012).
- Baker, T. C., Tymm, F. J. M., Murch, S. J. Assessing environmental exposure to β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in complex sample matrices: A comparison of the three most popular LC-MS/MS methods. Neurotoxicity Research. 33 (1), 43-54 (2018).
- Beach, D. G., Kerrin, E. S., Giddings, S. D., Quilliam, M. A., McCarron, P. Differential mobility-mass spectrometry double spike isotope dilution study of release of β-methylaminoalanine and proteinogenic amino acids during biological sample hydrolysis. Scientific Reports. 8, 117 (2018).
- Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A. A mechanism for slow release of biomagnified cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12228-12231 (2004).
- Banack, S. A., Murch, S. J., Cox, P. A. Neurotoxic flying foxes as dietary items for the Chamorro people, Marianas Islands. Journal of Ethnopharmacology. 106 (1), 97-104 (2006).
- van Onselen, R., Cook, N. A., Phelan, R. R., Downing, T. G. Bacteria do not incorporate β-N-methylamino-l-alanine into their proteins. Toxicon. 102, 55-61 (2015).
- Faassen, E. J., Gillissen, F., Zweers, H. A. J., Lürling, M. Determination of the neurotoxins BMAA (β-N-methylamino-L-alanine) and DAB (α-,γ-diaminobutyric acid) by LC-MSMS in Dutch urban waters with cyanobacterial blooms. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 79-84 (2009).
- Food and Drug Administration. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. U.S. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. , (2018).
- Reichelt, M., Hummert, C., Luckas, B. Hydrolysis of microcystins and nodularin by microwave radiation. Chromatographia. 49 (11), 671-677 (1999).
- Marconi, E., Panfili, G., Bruschi, L., Vivanti, V., Pizzoferrato, L. Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in food. Amino Acids. 8 (2), 201-208 (1995).
- Chen, S. -. T., Chiou, S. -. H., Chu, Y. -. H., Wang, K. -. T. Rapid hydrolysis of proteins and peptides by means of microwave technology and its application to amino acid analysis. International Journal of Peptide and Protein Research. 30 (4), 572-576 (1987).
- Aviram, L. Y., McCooeye, M., Mester, Z. Determination of underivatized amino acids in microsamples of a yeast nutritional supplement by LC-MS following microwave assisted acid hydrolysis. Analytical Methods. 8 (22), 4497-4503 (2016).
