Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu

NPAA’ların analizi için burada özetlenen ekstraksiyon protokolü, biyolojik numunelerdeki herhangi bir amino asidin analizi için geçerlidir. Siyanobakteriyel suşların izole edilmesi ve kültürlenmesi ile ilgili kılavuzlar için, Violi ve ^ark.38 tarafından çalışmada sunulan yöntemlere başvurulabilir. Protokoldeki ilk adım, numuneyi kuru ağırlığa karşı numuneler arasında normalleşmenin sağlanabileceği bir noktaya götürür. İkinci adım, analitleri serbest bırakmak için hücre lizisidir ve bu protokolde açıklandığı gibi prob sonikasyonu gibi mekanik bozulmalar / lizesler, donma / çözülme döngüleri, öğütme ve boncuk frezeleme ve enzimatik, deterjan ve / veya kimyasal lizis gibi mekanik olmayan bozulmalar dahil olmak üzere bir dizi teknik kullanılarak gerçekleştirilebilir. Mekanik bozulmanın, numunenin lize edilme kapasitesinin daha yüksek olmasına izin verirken, hücre içi bağların ve proteinlerin bozulmadan kalmasına izin verdiği için mekanik olmayanlara göre avantajlı olduğu bilinmektedir⁴¹, ancak örnek matrisi hücre lizasyonu için en uygun yöntemi belirleyebilir.

Protein çökeltisi, analiz için amino asitleri ekstrakte ederken bu protokolün kritik üçüncü adımıdır. TCA en yaygın kullanılan çözücüdür; Bununla birlikte, perklorik asit, aseton, metil tert-bütil eter (MTBE), metanol ve / veya asetonitril ^8,42 de kullanılmıştır, burada her ekstraksiyon çözücüsünün farklı substratları ekstrakte etmesi ve çökeltmesi amaçlanmıştır. Burada açıklanan model, NPAA BMAA’yı ve izomerlerini siyanobakteriyel bir matristen çıkarır ve bir dizi farklı çözücü kullanılmasına rağmen, en yaygın ikisi suda% 10 TCA (sulu) ve% 10 TCA’dır asetonda. Genel olarak, TCA ile protein çökeltmesi, proteine bağlı amino asitlerden serbest amino asitleri fraksiyone etmek için amino asitleri çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Ek olarak, TCA ekstraksiyonu, toplam protein içeriğinin belirlenmesine, serbest fraksiyon için kirleticilerin azaltılmasına ve minimum protein bozunumu ile proteazların aktivitesinin azaltılmasına izin verir⁴³. Serbest fraksiyonun TCA ekstraksiyonu, başlangıçta organik olarak çözünür maddeleri durulayarak, proteinlerin ve çökelti içindeki hücre duvarı kalıntıları gibi çözünmez bileşiklerin arkasında bırakarak çalışır, daha sonra güçlü bir asit kullanarak proteine bağlı amino asitlerin (bağlı fraksiyon) termal hidroliz ekstraksiyonu ile takip edilir.

Serbest fraksiyonun% 10 sulu TCA artı sonication ile fraksiyonasyonu, diğer organik çözücülere kıyasla en kapsamlı protein çökelmesini üretir⁴⁴ ve en iyi amino asit geri kazanımları⁴². Bazı çalışmalar, daha küçük peptitler / biyomoleküller de dahil olmak üzere daha fazla molekülü çökeltmek, protein bozulmasını en aza indirmek ve tuzlar gibi kirleticileri azaltmak için organik bir çözücü (yani% 10 -% 20 TCA⁴³) ile birleştirilmiş bir asit kullanmayı tercih etmektedir. Aseton içinde% 10 TCA’nın bir diğer avantajı, peletin hidroliz için hazırlanmasında daha hızlı kuruma hızıdır ve amino asit modifikasyonunu önlemek için nem kalıntısını en aza indirir. Bununla birlikte,% 10 sulu TCA artı sonikasyon, yalnızca asetonda% 10 TCA ile karşılaştırıldığında, serbest amino asitlerin^daha iyi ekstraksiyon verimliliğine sahiptir. Ek olarak,% 10 sulu TCA çökeltilmesi, uzun bir kuruma süresi, tüm proteinleri veya küçük peptitleri / biyomolekülleri çökiteyememek ve ilgilenilen analite (yani, proteinler veya amino asitler) bağlı olarak, oksidasyon ve bozulmayı önlemek için katkı maddeleri ve indirgeyici maddeler gerektirmesi gibi sınırlamalara sahiptir^45,46.

Bu protokol, protein çökelmesini arttırmak, daha küçük peptitlerin/biyomoleküllerin çökeltilmesini sağlamak, daha hızlı pelet kurutma sürelerine izin vermek ve her iki çözücü ekstraksiyon özelliğinden yararlanarak ekstraksiyon verimliliğini artırmak için asetonda %10 sulu TCA ve %10 TCA’nın bir kombinasyonunu kullanır. Bununla birlikte, asetonda% 10 sulu TCA ve% 10 TCA’nın kombinasyonu, aseton süpernatantındaki% 10 TCA, sulu serbest fraksiyon ile birleştirildikten sonra serbest fraksiyondaki küçük peptitleri / biyomolekülleri çökeltebilir. Bu durumda, çökeltiler hidroliz için bağlı fraksiyona aktarılmalıdır.

Bu protokolün ikinci yarısı, oksijensiz bir ortamda yüksek sıcaklıklarda asit-buhar hidrolizi yoluyla protein peletinden amino asitlerin (yani BMAA) salınmasını içerir. Hidroliz adımının ağırlıklı olarak sınırlayıcı faktörü, hazırlanmasının zaman alıcı ve zahmetli olmasıdır. Gece boyunca inkübasyon, hızlı ve zaman açısından verimli numune hazırlama ve analiz yapılmasını önler. Ek olarak, peletin bir santrifüj tüpünden bir kabuk şişesine kantitatif transferi (adım 3.4), kuru ağırlığa doğru bir normalleşme noktası sağlamak için özen ve sabır gerektiren zorlu bir işlemdir. Kullanıcının karşılaşabileceği olası sorunlar, peletin eksik transferi, pipet uçlarına ve orijinal tüpe yapışan ıslak çökeltilmiş proteinler ve pipet ucunu bloke eden pelet katı parçacıklarıdır. Peletin daha kolay aktarılmasına yardımcı olmak için pratik bir öneri, pipet ucunun ucundan yaklaşık 0,3-0,5 mm’yi bir çift makasla çıkarmak ve daha büyük pelet parçacıklarının çekilmesine ve kabuk şişesine salınmasına izin vermektir. Bu transfer yöntemi, tüm amino asit analizleri için protein ekstraksiyonu için yaygın bir uygulamadır. Bununla birlikte, peletin kabuk şişesine nicel olarak aktarılmasının verimliliğini ve doğruluğunu artırmak için yapılan değişiklikler araştırılmalıdır.

Amino asitleri proteine bağlı hallerinden serbest bırakmak için iki hidroliz tekniği formu kullanılabilir: sıvı faz hidrolizi ve asit-buhar hidrolizi. Numune üzerine 6 M HCl ilavesini içeren ve daha sonra gece boyunca 110 °C’lik bir fırına yerleştirilen sıvı fazlı hidroliz, bu protokolde açıklanan asit-buhar hidrolizine bir alternatiftir. Sıvı fazlı hidroliz kullanan ekstraksiyon teknikleri, özellikle AQC türevlendirmesi seçilirse,^40’ı etiketlemek için temel koşullar gerektirdiğinden, tuzdan arındırma gibi daha fazla işlem gerektirebilir. Asit-buhar hidrolizi, tuzdan arındırmayı önler ve kullanıcıya, filtrasyondan önce son peletin yeniden sulandırılması üzerine türevlendirme tekniğini seçme özgürlüğü verir. Ayrıca, seçilen hidroliz yönteminden bağımsız olarak, numuneler, türevlendirme tekniği seçimine ve/veya analitik analize bağlı olarak matris saflaştırma ve konsantrasyon 29,47,48 için SPE gibi daha ileri işlemler gerektirebilir (örneğin^, ters faz LC-MS/MS ve hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi [HILIC] LC-MS/MS ³⁷ ). Bu protokolde 20 mM HCl’deki nihai peletin sulandırılması, ticari olarak temin edilebilen bir amino asit hidroliz kiti³⁹ aracılığıyla PCF reaktifleri⁴⁸ kullanılarak türevlendirme için uygundur (bkz. Hem AQC hem de PCF, numunede bulunan tüm amino asitleri, proteini ve protein olmayan kökeni türeyecektir ve analitlerin seçiciliği, LC-MS / MS kullanımı ve tutma süresi eşleşmesi kombinasyonu ve niceleyici ve niteleyici MRM’lerin dikkatli seçimi³⁸ ile elde edilir. 

Mevcut hidroliz protokolleri, BMAA, 2,4-DAB ve AEG salınımı için değil, protein hidrolizi 32 için mevcut yöntemlere dayanan²² protein amino asidi için optimize edilmiştir; burada 18 saatten daha uzun süre inkübasyon, belirli amino asitlerin parçalanması ve modifikasyonu ile sonuçlanır, bu da LC-MS / MS analizini ve dolayısıyla elde edilen konsantrasyonları^{etkiler 32}. Beach ve ^ark.49, BMAA ve proteinojenik amino asitleri analiz etmek için hidrolizi optimize etmek için zaman içinde (0.5-120 saat) hidrolizi araştırdı. Hidrolizin ilk 0.5 saatinde BMAA’nın erken hızlı bir şekilde salınmasına rağmen, hidroliz süresi arttıkça, 5 gün^49’dan sonra bile, bozulmadan BMAA seviyelerinin artmaya devam ettiğini bulmuşlardır. Bağlı BMAA ve izomerlerinin gerçek doğası hakkında hala farklı görüşler ve sorular vardır, bazı çalışmalar ^BMAA’nın 50,51’i bağlaması veya proteinlere yanlış dahil edilmesi yerine¹⁴, BMAA-protein ilişkisinin yüzeysel olduğunu düşündürmektedir ⁵². Bununla birlikte, “bağlı” BMAA’nın analizindeki mevcut fikir birliği, amino asitleri ve dolayısıyla BMAA ve izomerlerini serbest bırakmak için peptitleri / proteinleri parçalayan doğrulanmış ve yaygın olarak kabul edilen hidroliz adımını gerektirir.

20 protein amino asidinin geri kazanım oranları, Sedgwick ve ^ark.42 tarafından TCA ekstraksiyonu kullanılarak yapılan bir çalışmada belirlendi ve yaklaşık% 100 iyileşme ile sonuçlandı. BMAA ve alg matrislerinden izomerleri söz konusu olduğunda, çeşitli ekstraksiyon çözücüleri kullanarak BMAA ekstraksiyonunun verimliliğini karşılaştıran çalışmalar,% 10 TCA’nın serbest BMAA²⁷ için en verimli olduğunu bulmuştur. Sıvı faz hidrolizi kullanılarak ekstrakte edilen proteine bağlı BMAA için geri kazanım oranları, Glover ve ^ark.25 ve Faassen ve ^ark.53 tarafından yapılan çalışmalarda, doğruluğun çivili geri kazanım yöntemleriyle belirlendiği, ortalama BMAA geri kazanım oranının sırasıyla% 108.6 ve% 70 olduğu çalışmalarda belirlenmiştir. Faassen ve ark. başak kurtarma deneyleri için prosedürleri tanımladılar ve başak ekstraksiyon işleminin aşamasına bağlı olarak iyileşmenin nasıl değiştiğini gösterdiler⁵³. Faassen ve ark. ayrıca burada sunulan asit-buhar protokolünün verimliliğini belirlemiş, ekstraksiyondan önce çivilenmiş BMAA izomerleri için% 83.6 ve hidroliz^24’ten önce çivilenenler için% 68.6’lık geri kazanım oranları ile belirlenmiştir. Bu geri kazanımlar, ekstraksiyon yöntemleri ve analizler Banack 26 tarafından daha da doğrulandı, siyanobakteriyel bir matriste BMAA için% 94-106 iyileşme oranları ve% 5.6 ile% 20 arasında bir Göreceli Standart Sapma (RSD)% 5.6 ile%²⁰ arasında, doğruluk için FDA kriterlerini karşıladı⁵⁴. Her laboratuvarın bu protokolü başak kurtarma deneyleri yoluyla kullanmadan önce başlangıçta geri kazanım oranlarını ve doğruluğunu belirlemesi önerilir. Faassen ve ^ark.53 ve Glover ve ^ark.25’te sunulan iyileşme yöntemleri kılavuz olarak takip edilebilir.

Analitin proteine daha hızlı ekstraksiyonu için gece boyunca fırın hidrolizi yerine hidroliz tekniklerinin alternatif formları kullanılabilir. Örneğin, bir mikrodalga ekstraktör, hidroliz süresini 24 saatten 10 dakika^55’e kadar önemli ölçüde azaltabilir. Amino asitler için mikrodalga hidrolizi, mikrodalga kabını oksijensiz bir ortamda hazırlamak ve monte etmek için bir torpido gözü kullanarak ve 6 M HCl ekleyerek geleneksel termal yöntemle aynı prensipleri kullanır. Hava geçirmez olduğunda, numuneyi içeren kap mikrodalga radyasyonuna maruz kalır. Mikrodalga hidrolizi, çeşitli numune matrislerinden amino asitleri çıkarmak için kullanılmıştır^56,57,58; Bununla birlikte, BMAA’nın analizi için mikrodalga hidrolizi henüz geliştirilmemiş ve doğrulanmamıştır.

Sonuç olarak,% 10 sulu TCA protein çökeltmesi, siyanobakteriyel matrislerden serbest protein olmayan amino asitleri çıkarmak için en uygun yöntemdir²⁷ ve termal hidroliz, proteine bağlı fraksiyonun güvenilir ve tekrarlanabilir bir ekstraksiyonunu sağlar. NPAA BMAA’yı ve izomerlerini siyanobakterilerden çıkarmak için kullanılan bu protokol doğrulanmıştır ve yaygın olarak kabul edilmektedir. BMAA’nın ekstraksiyonunu daha da optimize etmek için gelecekteki talimatlar, 22 protein amino asidinin özelliklerine göre gerçekleştirilen hidroliz adımına odaklanacaktır. Bununla birlikte, burada sunulan ekstraksiyon protokolü, BMAA’yı ve izomerlerini LC-MS / MS aracılığıyla analiz etmek için hala verimli ve etkili olarak kabul edilmelidir.