Extração de Aminoácidos Não Proteicos de Cianobactérias para Cromatografia Líquida - Análise de Espectrometria de Massas em Tandem

O protocolo de extração descrito aqui para a análise de NPAAs aplica-se à análise de quaisquer aminoácidos em amostras biológicas. Para guias sobre isolamento e cultivo de cepas cianobacterianas, pode-se consultar os métodos apresentados no estudo de Violi et ^al.38. A primeira etapa do protocolo leva a amostra a um ponto em que a normalização entre as amostras em relação ao peso seco pode ser alcançada. O segundo passo é a lise celular para liberar os analitos e pode ser realizada usando uma série de técnicas, incluindo rupturas mecânicas / lises, como sonicação da sonda, conforme descrito neste protocolo, ciclos de congelamento / descongelamento, moagem e moagem de contas e rupturas não mecânicas, como lise enzimática, detergente e / ou química. Sabe-se que a ruptura mecânica é vantajosa em relação à não mecânica, pois permite uma maior capacidade da amostra de lisar, permitindo que as ligações intracelulares e as proteínas permaneçam intactas⁴¹, embora a matriz da amostra possa ditar o método ideal para a lise celular.

A precipitação de proteínas é o terceiro passo crítico deste protocolo ao extrair aminoácidos para análise. O TCA é o solvente mais comumente usado; no entanto, ácido perclórico, acetona, éter metil-terc-butílico (MTBE), metanol e/ou acetonitrila ^8,42 também foram utilizados, onde cada solvente de extração é destinado a extrair e precipitar diferentes substratos. O modelo aqui descrito extrai o NPAA BMAA e seus isômeros de uma matriz cianobacteriana e, embora uma gama de solventes diferentes tenha sido utilizada, os dois mais comuns são 10% de TCA em água (aquosa) e 10% de TCA em acetona. Em geral, a precipitação de proteínas com TCA é comumente usada para extrair aminoácidos para fracionar aminoácidos livres dos aminoácidos ligados à proteína. Além disso, a extração de TCA permite determinar o teor de proteína total, reduzindo os contaminantes para a fração livre e reduzindo a atividade das proteases com degradação proteica mínima⁴³. A extração de TCA da fração livre funciona enxaguando inicialmente substâncias orgânico-solúveis, deixando para trás proteínas e compostos insolúveis, como restos de parede celular no precipitado, que é seguida pela extração de hidrólise térmica dos aminoácidos ligados à proteína (fração ligada) usando um ácido forte.

O fracionamento da fração livre com 10% de TCA aquoso mais sonicação produz a precipitação proteica mais extensa em comparação com outros solventes orgânicos⁴⁴ e as melhores recuperações de aminoácidos⁴². Alguns estudos optam por usar um ácido combinado com um solvente orgânico (ou seja, 10%-20% de TCA na acetona 43) para precipitar mais moléculas, incluindo peptídeos / biomoléculas menores, minimizar a degradação de proteínas e reduzir contaminantes, como sais⁴³. Outra vantagem do TCA de 10% na acetona é sua taxa de secagem mais rápida na preparação do pellet para hidrólise, minimizando o resíduo de umidade para evitar a modificação de aminoácidos. No entanto, 10% de TCA aquoso mais sonicação tem melhores eficiências de extração de aminoácidos livres quando comparado a 10% de TCA na acetona⁴⁴ sozinha. Além disso, a precipitação aquosa de TCA a 10% apresenta limitações como um longo tempo de secagem, não sendo capaz de precipitar todas as proteínas ou pequenos peptídeos/biomoléculas, e dependendo do analito de interesse (ou seja, proteínas ou aminoácidos), necessitando de aditivos e agentes redutores para prevenir a oxidação e degradação^45,46.

Este protocolo usa uma combinação de 10% de TCA aquoso e 10% de TCA em acetona para aumentar a precipitação de proteínas, garantir que peptídeos/biomoléculas menores sejam precipitados, permitir tempos de secagem de pellets mais rápidos e aumentar a eficiência da extração, aproveitando ambas as propriedades de extração com solvente. No entanto, a combinação de 10% de TCA aquoso e 10% de TCA em acetona pode precipitar pequenos peptídeos/biomoléculas na fração livre após o 10% de TCA no sobrenadante de acetona ser combinado com a fração livre aquosa. Neste caso, os precipitados devem ser transferidos para a fração ligada para hidrólise.

A segunda metade deste protocolo envolve a liberação de aminoácidos (ou seja, BMAA) do pellet de proteína via hidrólise ácido-vapor a temperaturas elevadas em um ambiente livre de oxigênio. O fator predominantemente limitante para a etapa de hidrólise é que é demorado e trabalhoso de preparar. A incubação durante a noite impede a preparação e análise de amostras rápidas e eficientes em termos de tempo. Além disso, a transferência quantitativa do pellet de um tubo de centrífuga para um frasco para injetáveis (passo 3.4) é um processo árduo que requer diligência e paciência para garantir um ponto preciso de normalização para o peso seco. Possíveis problemas que o usuário pode enfrentar são a transferência incompleta do pellet, proteínas precipitadas úmidas aderindo às pontas da pipeta e ao tubo original e partículas sólidas do pellet bloqueando a ponta da pipeta. Uma sugestão prática para ajudar a uma transferência mais fácil do pellet é remover cerca de 0,3-0,5 mm da extremidade da ponta da pipeta com um par de tesouras, permitindo que partículas maiores de pellets sejam retiradas e liberadas no frasco para injetáveis da casca. Este método de transferência é uma prática comum para a extração de proteínas para todas as análises de aminoácidos. No entanto, devem ser investigadas modificações para melhorar a eficiência e a precisão da transferência quantitativa do pellet para o frasco para injetáveis de concha.

Duas formas de técnicas de hidrólise podem ser empregadas para liberar aminoácidos de seu estado ligado às proteínas: hidrólise em fase líquida e hidrólise ácido-vapor. A hidrólise em fase líquida, que envolve a adição de HCl 6 M à amostra, que é então colocada em forno a 110 °C durante a noite, é uma alternativa à hidrólise ácido-vapor descrita neste protocolo. Técnicas de extração que empregam hidrólise em fase líquida podem exigir processamento adicional, como a dessalinização, especialmente se a derivatização de AQC for escolhida, pois requer condições básicas para a marcação⁴⁰. A hidrólise ácido-vapor evita a dessalinização e permite ao usuário a liberdade de escolher a técnica de derivatização após a reconstituição do pellet final antes da filtração. Além disso, independentemente do método de hidrólise escolhido, as amostras podem necessitar de processamento adicional, como SPE para purificação e concentração da matriz 29,47,48, dependendo da escolha da técnica de derivatização e/ou análise analítica (por exemplo^, fase reversa LC-MS/MS vs. cromatografia líquida de interação hidrofílica [HILIC] LC-MS/MS ³⁷ ). A reconstituição do pellet final em HCl 20 mM neste protocolo é apropriada para derivatização usando reagentes PCF⁴⁸através de um kit de hidrólise de aminoácidos³⁹ comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Tanto o AQC quanto o PCF derivarão todos os aminoácidos, proteínas e não proteínas de origem presentes na amostra, e a seletividade dos analitos é obtida através do uso de LC-MS/MS e sua combinação de correspondência de tempo de retenção e seleção cuidadosa do quantificador e qualificador MRMs³⁸. 

Os protocolos atuais de hidrólise não são otimizados para a liberação de BMAA, 2,4-DAB e AEG, mas para os 22 aminoácidos proteicos baseados nos métodos existentes para hidrólise proteica 32, onde a incubação por mais de 18 h resulta na degradação e modificação de certos aminoácidos, afetando a análise LC-MS/MS e, portanto, as concentrações obtidas³². Beach et ^al.49 investigaram a hidrólise ao longo do tempo (0,5-120 h) para otimizar a hidrólise para análise do BMAA e dos aminoácidos proteinogênicos. Eles descobriram que, embora tenha havido uma liberação rápida precoce de BMAA durante os primeiros 0,5 h da hidrólise, os níveis de BMAA continuaram a aumentar à medida que o tempo de hidrólise aumentava, sem degradação, mesmo após 5 dias⁴⁹. Há também ainda diferentes visões e questões sobre a verdadeira natureza do BMAA ligado e seus isômeros, com alguns estudos sugerindo que, em vez de ligação BMAA 50,51 ou má incorporação em proteínas^14, a associação BMAA-proteína é superficial⁵². No entanto, o consenso atual na análise do BMAA “ligado” requer a etapa de hidrólise validada e amplamente aceita que separa peptídeos / proteínas para liberar aminoácidos e, portanto, BMAA e seus isômeros.

As taxas de recuperação de 20 aminoácidos proteicos foram determinadas em um estudo de Sedgwick et ^al.42 utilizando a extração de TCA, resultando em aproximadamente 100% de recuperação. No caso do BMAA e seus isômeros de matrizes de algas, estudos comparando a eficiência da extração de BMAA utilizando vários solventes de extração encontraram 10% de TCA como o mais eficiente para BMAA livre²⁷. As taxas de recuperação do BMAA ligado à proteína extraído por hidrólise em fase líquida foram estabelecidas em estudos de Glover et ^al.25 e de Faassen et ^al.53, onde a acurácia foi determinada por métodos de recuperação spiked, com uma taxa média de recuperação do BMAA de 108,6% e 70%, respectivamente. Faassen et al. descreveram procedimentos para experimentos de recuperação de spike e ilustraram como a recuperação difere dependendo do estágio do processo de extração que o spike foi feito⁵³. Faassen e col. determinaram adicionalmente a eficiência do protocolo ácido-vapor aqui apresentado, com taxas de recuperação de 83,6% para os isômeros BMAA cravados antes da extração e 68,6% para aqueles cravados antes da hidrólise²⁴. Essas recuperações, métodos de extração e análises foram validados por Banack 26, com taxas de recuperação de 94%-106% para BMAA em uma matriz cianobacteriana e um %Desvio Padrão Relativo (%RSD) entre 5,6% e²⁰%, atendendo aos critérios de precisão da FDA⁵⁴. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça inicialmente suas taxas de recuperação e precisão antes de utilizar este protocolo por meio de experimentos de recuperação de pico. Os métodos de recuperação apresentados em Faassen et ^al.53 e Glover et ^al.25 podem ser seguidos como guia.

Formas alternativas de técnicas de hidrólise podem ser utilizadas em vez de hidrólise em forno durante a noite para uma extração mais rápida ligada às proteínas do analito. Por exemplo, um extrator de micro-ondas poderia reduzir significativamente o tempo de hidrólise de 24 h para apenas 10 min⁵⁵. A hidrólise de micro-ondas para aminoácidos usa os mesmos princípios que o método térmico convencional, usando um porta-luvas para preparar e montar o recipiente de micro-ondas em um ambiente livre de oxigênio e adicionando 6 M HCl. Uma vez hermético, o recipiente que contém a amostra sofre radiação de micro-ondas. A hidrólise de micro-ondas tem sido utilizada para extrair aminoácidos de várias matrizes de amostras^56,57,58; no entanto, a hidrólise de micro-ondas ainda não foi desenvolvida e validada para a análise do BMAA.

Em conclusão, a precipitação aquosa de 10% da proteína TCA é o método ideal para extrair aminoácidos livres não proteicos de matrizes cianobacterianas²⁷, e a hidrólise térmica fornece uma extração confiável e reprodutível da fração ligada à proteína. Este protocolo para extrair o NPAA BMAA e seus isômeros de cianobactérias é validado e amplamente aceito. Direções futuras para otimizar ainda mais a extração de BMAA se concentrarão na etapa de hidrólise, que é realizada de acordo com as especificações dos 22 aminoácidos proteicos. No entanto, o protocolo de extração aqui apresentado ainda deve ser considerado eficiente e eficaz para a análise do BMAA e seus isômeros via LC-MS/MS.