Обнаружение и количественное определение клеток, удерживающих метки, в резцах мышей с использованием подхода 3D-реконструкции после очистки тканей

Непрерывно растущий резец мыши является отличной моделью для изучения взрослых стволовых клеток¹. Эпителиальные (губная и язычная шейная петля) и мезенхимальные стволовые клетки (между лабиальной и язычной шейной петлей), которые находятся на проксимальной стороне резца, дифференцируются в амелобласты, одонтобласты и клетки пульпы зуба. Этот уникальный процесс обеспечивает источник клеток для компенсации потери и обновления тканей². Хотя несколько маркеров стволовых клеток, таких как Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 и т. Д. были идентифицированы in vivo для подмножеств взрослых стволовых клеток в резцах мышей, они неадекватны в представлении популяций стволовых клеток при использовании только 1,3,4,5. Визуализация долгоживущих спокойных клеток с помощью нуклеотидной аналоговой маркировки и удержания ДНК может обеспечить объективное обнаружение для большинства подмножеств взрослых стволовых клеток⁶. Кроме того, этот подход полезен среди многих методов идентификации стволовых клеток⁷ для понимания поведения клеток и гомеостаза популяций стволовых клеток^{зубов 3,8}. В то время как делящиеся стволовые клетки теряют свою маркировку ДНК после значительной погони, предполагаемые спокойные стволовые клетки сохраняют свою метку ДНК, считая их клетками, сохраняющими метки (LRC)⁶. Маркировка и удержание ДНК неделящимися стволовыми клетками пометит и обнаружит предполагаемые взрослые стволовые клетки в их нишах.

За последние годы маркировка аналогом тимидина 5-бром-2′-дезоксиуридина (BrdU) заменила громоздкий, трудоемкий и несовместимый с микроскопией высокого разрешения метод маркировки ДНК 3H-тимидина для анализов пролиферации клеток ^6,9. В последние годы метод маркировки 5-этинил-2′-дезоксиуридина (EdU) все чаще используется в BrdU. Такая закономерность возникла по нескольким причинам. Во-первых, метод BrdU медленный и трудоемкий. Условия использования варьируются, и он не может сохранить ультраструктуру в образцах (из-за денатурации ДНК). Аналогичным образом, метод BrdU теряет антигенность клеток, что делает его неэффективным для последующих функциональных анализов и анализов, таких как эксперименты по совместной локализации и трансплантация стволовых клеток in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU также является тератогеном, который не подходит для маркировки LRC в эмбриональном развитии⁶. Кроме того, метод BrdU неэффективен при использовании в образцах с цельным креплением. Недостатками являются низкое проникновение антител в глубокую часть образцов или требование длительного инкубационного периода антител для глубокого проникновения¹³. Маркировка EdU избегает этапов денатурации образцов, тем самым сохраняя ультраструктуру. Эта особенность выгодна для последующих функциональных анализов, таких как эксперименты по совместной локализации и трансплантация стволовых клеток^11,12. Кроме того, маркировка EdU очень чувствительна и быстра; Проникновение образцов является высоким из-за использования быстро поглощаемых и меньших по размеру флуоресцентных азидов для детектирования меток EdU через катализируемую Cu (I) [3 + 2] реакцию циклоприсоединения («клик»)¹⁴.

Другим все более применяемым методом маркировки ДНК является использование сконструированных трансгенных мышей. Эти мыши экспрессируют зеленый флуоресцентный белок гистона 2B (H2B-GFP), контролируемый чувствительным к тетрациклину регуляторным элементом ^5,14. После кормления мышей тетрациклиновым кормом / водой в течение периода преследования от 4 недель до 4 месяцев флуоресценция GFP будет уменьшаться в циклических клетках, и только LRC сохранят флуоресценцию⁶. Преимущество этого метода заключается в том, что меченые LRC могут быть выделены и остаются жизнеспособными для культивирования клеток или последующего функционального анализа ^6,7. В некоторых исследованиях сообщалось о неточной маркировке стволовых клеток, находящихся в состоянии покоя, при длительном использовании. Этот результат был обусловлен негерметичной фоновой экспрессией штамма H2B-GFP, а не соответствующим тетрациклин-регулируемым ответом¹⁵.

Более того, в большинстве литературы в прошлом детектирование ЦУР использовалось в основном на секционных слайдах, которые являются двумерными и часто ошибочно предвзятыми в показе точного местоположения и количества ЦУР. Подход показал неправильные углы для срезов сложных тканевых структур¹⁶. Другой метод заключался в получении 3D-изображений из серийных срезов и выполнении реконструкций после изображения. Эти шаги были неточными из-за искажения изображения из-за вариаций в каждой последовательной секции из-за сжатых или растянутых секций, что привело к отсутствию информации^16,17,18. Метод также был трудоемким и длительным.

Чтобы облегчить визуализацию LRC во всей монтировке, образцы должны быть четкими, а флуоресценция должна поддерживаться в хорошем состоянии. Современные методы очистки тканей можно разделить на три основные категории: методы очистки тканей на основе органических растворителей, методы очистки тканей на основе водных реагентов и методы очистки тканей на основе гидрогеля^17,19. Недавно была разработана система растворителей, связанная с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (PEGASOS). Этот подход делает почти все типы тканей прозрачными и сохраняет эндогенную флуоресценцию, включая твердые ткани, такие как кости и зубы²⁰. Метод PEGASOS имеет преимущества перед другими методами очистки тканей, особенно при очистке зубных и костных материалов. Большинство других методов могут лишь частично очищать твердые ткани, иметь длительное время обработки или требовать дорогостоящих реагентов²¹. Кроме того, метод PEGASOS может эффективно сохранять эндогенную флуоресценцию по сравнению с другими методами.

Эта литература привела нас к созданию нового метода исследования клеток. Мы объединили преимущества маркировки EdU для обнаружения LRC с наиболее превосходной 3D-визуализацией образцов, очищенных от ткани; образцы обрабатывали с использованием усовершенствованной технологии очистки тканей с помощью системы растворителей, связанной с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (PEGASOS)¹⁵. Прозрачность твердых тканей позволила нам реконструировать 3D-сигнал флуоресценции LRC in vivo без разрушения зубов или нижней челюсти, создав более точный способ визуализации и количественной оценки LRC.

В этом исследовании мы представляем инновационное руководство по визуализации LRC в резце мыши. Мы использовали 3D-визуальный подход для определения местоположения и количества LRC в нише стволовых клеток резцов мыши. В этом проекте использовалась маркировка EdU, методы очистки тканей PEGASOS и конфокальная микроскопия. Наш метод маркировки EdU LRC на цельной ткани и использование очищенного и прозрачного образца преодолевает как ограничения традиционных секционных слайдов, так и другие невыгодные методы маркировки ДНК. Таким образом, наша методика будет пригодна для исследований гомеостаза стволовых клеток, требующих обнаружения ЛРК, особенно на твердых тканях. Протокол может быть одинаково полезен для тех, кто фокусируется на гомеостазе стволовых клеток в других тканях и органах.