Rilevamento e quantificazione delle cellule che conservano l'etichetta negli incisivi di topo utilizzando un approccio di ricostruzione 3D dopo la pulizia dei tessuti

L’incisivo di topo in continua crescita è un modello eccellente per lo studio delle cellule staminali adulte¹. Le cellule staminali epiteliali (ansa cervicale labiale e linguale) e mesenchimali (tra l’ansa cervicale labiale e linguale) che risiedono sul lato prossimale dell’incisivo si differenziano in ameloblasti, odontoblasti e cellule polpa dentali. Questo processo unico fornisce una fonte di cellule per la compensazione della perdita di tessuto e del turnover². Anche se diversi marcatori di cellule staminali come Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, ecc. sono stati identificati in vivo per i sottogruppi di cellule staminali adulte negli incisivi di topo, sono inadeguati nel rappresentare le popolazioni di cellule staminali quando usati da soli 1,3,4,5. La visualizzazione di cellule quiescenti a lunga vita mediante marcatura e ritenzione del DNA analogico nucleotidico potrebbe fornire un rilevamento imparziale per la maggior parte dei sottogruppi di cellule staminali adulte⁶. Inoltre, questo approccio è utile tra molti metodi di identificazione delle cellule staminali⁷ per comprendere il comportamento cellulare e l’omeostasi delle popolazioni di cellule staminali dentali ^3,8. Mentre le cellule staminali in divisione perderebbero la loro etichettatura del DNA dopo un considerevole inseguimento, le presunte cellule staminali quiescenti mantengono la loro etichetta di DNA, ritenendole cellule che mantengono l’etichetta (LRC)⁶. L’etichettatura e la conservazione del DNA da parte di cellule staminali non in divisione segneranno e localizzeranno le cellule staminali adulte putative nelle loro nicchie.

Negli ultimi anni, l’analogo della timidina 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) ha sostituito l’ingombrante, dispendioso in termini di tempo e ad alta risoluzione incompatibile metodo di marcatura del DNA 3H-timidina per i saggi di proliferazione cellulare ^6,9. Negli ultimi anni, la tecnica di etichettatura della 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) è stata sempre più utilizzata su BrdU. Questo modello è emerso a causa di diversi motivi. In primo luogo, il metodo BrdU è lento e laborioso. Le condizioni dell’utente sono variabili e non è in grado di preservare l’ultrastruttura nei campioni (a causa della denaturazione del DNA). Allo stesso modo, il metodo BrdU perde l’antigenicità delle cellule, rendendolo così inefficiente per analisi funzionali a valle e saggi come gli esperimenti di co-localizzazione e il trapianto di cellule staminali in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU è anche un teratogeno, che non è adatto per etichettare LRC nello sviluppo embrionale⁶. Inoltre, il metodo BrdU è inefficiente se utilizzato nei campioni a montaggio intero. Gli svantaggi sono la bassa penetrazione degli anticorpi nella parte profonda dei campioni o la necessità di un lungo periodo di incubazione degli anticorpi per la penetrazione profonda¹³. L’etichettatura EdU sfugge alle fasi di denaturazione dei campioni, preservando così l’ultrastruttura. Questa caratteristica è vantaggiosa per le analisi funzionali a valle come esperimenti di co-localizzazione e trapianto di cellule staminali^11,12. Inoltre, l’etichettatura EdU è altamente sensibile e rapida; La penetrazione dei campioni è elevata grazie all’uso di azidi fluorescenti ad assorbimento rapido e di dimensioni più piccole per rilevare etichette EdU attraverso una reazione di cicloaddizione catalizzata da Cu(I) [3 + 2] (chimica a “clic”)¹⁴.

Un altro metodo di marcatura del DNA sempre più applicato è l’uso di topi transgenici ingegnerizzati. Questi topi esprimono la proteina fluorescente verde dell’istone 2B (H2B-GFP) controllata da un elemento regolatore sensibile alla tetraciclina ^5,14. Dopo aver alimentato i topi con tetraciclina chow/acqua per un periodo di inseguimento da 4 settimane a 4 mesi, la fluorescenza GFP diminuirà nelle cellule cicliche e solo gli LRC manterranno la fluorescenza⁶. Il vantaggio di questo metodo è che le LRC marcate possono essere isolate e rimanere vitali per la coltura cellulare o le analisi funzionali a valle ^6,7. Alcuni studi hanno riportato un’etichettatura imprecisa delle cellule staminali quiescenti quando inseguite per un uso a lungo termine. Questo risultato era dovuto a un’espressione di fondo permeabile dal ceppo H2B-GFP e non alla risposta appropriata regolata dalla tetraciclina¹⁵.

Inoltre, la maggior parte della letteratura in passato utilizzava il rilevamento degli LRC principalmente su vetrini sezionati, che sono bidimensionali e spesso erroneamente distorti nel mostrare la posizione accurata e il numero di LRC. L’approccio ha mostrato angoli errati per sezioni di strutture tissutali complesse¹⁶. L’altro metodo era quello di ottenere immagini 3D da sezioni seriali ed eseguire ricostruzioni post-immagine. Questi passaggi erano imprecisi a causa della distorsione dell’immagine dovuta alle variazioni in ogni sezione seriale a causa di sezioni compresse o allungate, con conseguente perdita di informazioni^16,17,18. Il metodo era anche laborioso e richiedeva molto tempo.

Per facilitare l’imaging completo degli LRC, i campioni devono essere chiari mentre la fluorescenza deve essere ben mantenuta. Le attuali tecniche di pulizia dei tessuti possono essere classificate in tre categorie principali: tecniche di pulizia dei tessuti a base di solventi organici, tecniche di pulizia dei tessuti a base di reagenti acquosi e tecniche di pulizia dei tessuti a base di idrogel^17,19. Il sistema solvente associato al glicole polietilenico (PEG) (PEGASOS) è stato recentemente sviluppato. Questo approccio rende trasparenti quasi tutti i tipi di tessuti e preserva la fluorescenza endogena, compresi i tessuti duri come ossa e denti²⁰. Il metodo PEGASOS presenta vantaggi rispetto ad altri metodi di pulizia dei tessuti, specialmente nella pulizia dei materiali dentali e ossei. La maggior parte degli altri metodi potrebbe eliminare solo parzialmente i tessuti duri, avere lunghi tempi di lavorazione o richiedere costosi reagenti²¹. Inoltre, il metodo PEGASOS può preservare efficacemente la fluorescenza endogena rispetto ad altri metodi.

Questa letteratura ci ha portato a creare un nuovo metodo per lo studio cellulare. Abbiamo combinato i vantaggi di rilevamento LRC dell’etichettatura EdU con l’imaging 3D a montaggio intero più superiore di campioni eliminati dai tessuti; i campioni sono stati elaborati con la tecnica di pulizia dei tessuti PEGASOS (Advanced Polyethylene Glycol (PEG)-associated solvent system (PEGASOS)¹⁵. La trasparenza dei tessuti duri ci ha permesso di ricostruire il segnale 3D della fluorescenza delle LRC in vivo senza rompere i denti o la mandibola, creando un modo più accurato per visualizzare e quantificare gli LRC.

In questo studio, forniamo una guida innovativa per visualizzare gli LRC nell’incisivo del topo. Abbiamo realizzato un approccio visivo 3D per determinare la posizione e la quantità di LRC all’interno della nicchia delle cellule staminali incisive del topo. Questo progetto ha utilizzato l’etichettatura EdU, le tecniche di eliminazione dei tessuti PEGASOS e la microscopia confocale. Il nostro metodo di marcatura EdU degli LRC su tessuto a montaggio intero e l’uso di un campione chiaro e trasparente supera sia i limiti dei tradizionali vetrini sezionati che altri metodi di etichettatura del DNA svantaggiosi. Pertanto, la nostra tecnica sarà adatta per studi sull’omeostasi delle cellule staminali che richiedono il rilevamento di LRC, in particolare sui tessuti duri. Il protocollo può essere ugualmente vantaggioso per coloro che si concentrano sull’omeostasi delle cellule staminali in altri tessuti e organi.