الكشف عن وكمية خلايا الاحتفاظ بالتسمية في قواطع الماوس باستخدام نهج إعادة البناء 3D بعد إزالة الأنسجة
Summary
تحتوي قاطعة الفأر على خلايا قيمة للاحتفاظ بالتسمية في مكانتها للخلايا الجذعية. لدينا طريقة جديدة لاكتشاف الخلايا التي تحتفظ بالتسمية وتحديدها بشكل غير متحيز. استخدمت دراستنا وضع العلامات EdU ونهج إعادة الإعمار 3D بعد تطهير أنسجة PEGASOS من الفك السفلي.
Abstract
قاطعة الفئران هي عضو ينمو باستمرار طوال عمر الفأر. تؤدي الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة الموجودة في الأنسجة القريبة من القواطع إلى ظهور ذرية تتمايز إلى أرومات المينائية والأرومات السنية والخلايا الليفية اللبية. هذه الخلايا ضرورية في دعم الدوران المستمر للأنسجة القاطعة ، مما يجعل قاطعة الفئران نموذجا ممتازا لدراسة توازن الخلايا الجذعية البالغة. يعتقد أن الخلايا الجذعية تحتوي على خلايا هادئة طويلة العمر يمكن تصنيفها بواسطة نظائر النوكليوتيدات مثل 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU). تحتفظ الخلايا بهذه التسمية بمرور الوقت وتسمى وفقا لذلك خلايا الاحتفاظ بالتسمية (LRCs). توفر مناهج تصور مراكز مصادر التعلم في الجسم الحي أداة قوية لمراقبة توازن الخلايا الجذعية. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتصور وتحليل مراكز مصادر التعلم. يتميز نهجنا المبتكر بمراكز مصادر التعلم في قواطع الماوس بعد إزالة الأنسجة وتلطيخ EdU الكامل متبوعا بالفحص المجهري متحد البؤر وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام برنامج التصوير. تتيح هذه الطريقة الحصول على تصوير 3D والقياس الكمي غير المتحيز مقارنة بتحليل LRCs التقليدي على الشرائح المقسمة.
Introduction
تعد قاطعة الماوس المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية البالغة1. تتمايز الخلايا الجذعية الظهارية (حلقة عنق الرحم الشفوية واللسانية) والخلايا الجذعية الوسيطة (بين حلقة عنق الرحم الشفوية واللسانية) الموجودة على الجانب القريب من القاطعة إلى الأرومات المينائية والأرومات السنية وخلايا لب الأسنان. توفر هذه العملية الفريدة مصدرا للخلايا لتعويض فقدان الأنسجة ودورانها2. على الرغم من وجود العديد من علامات الخلايا الجذعية مثل Sox2 و Gli1 و Thy1 / CD90 و Bmi1 وما إلى ذلك. تم تحديدها في الجسم الحي لمجموعات فرعية من الخلايا الجذعية البالغة في قواطع الفئران ، فهي غير كافية في تمثيل مجموعات الخلايا الجذعية عند استخدامها بمفردها1،3،4،5. يمكن أن يوفر تصور الخلايا الهادئة طويلة العمر عن طريق وسم الحمض النووي التناظري للنيوكليوتيدات والاحتفاظ به اكتشافا غير متحيز لمعظم المجموعات الفرعية من الخلايا الجذعية البالغة6. علاوة على ذلك ، يعد هذا النهج مفيدا بين العديد من طرق تحديد الخلايا الجذعية7 لفهم سلوك الخلايا وتوازن مجموعات الخلايا الجذعية السنية 3,8. في حين أن الخلايا الجذعية المنقسمة ستفقد علامات الحمض النووي الخاصة بها بعد مطاردة كبيرة ، فإن الخلايا الجذعية الهادئة المفترضة تحتفظ بتسمية الحمض النووي الخاصة بها ، معتبرة أنها خلايا تحتفظ بالتسمية (LRCs)6. سيؤدي وضع علامات الحمض النووي والاحتفاظ به بواسطة الخلايا الجذعية غير المنقسمة إلى تحديد وتحديد موقع الخلايا الجذعية البالغة المفترضة في منافذها.
على مدى السنوات الماضية ، حل وضع العلامات التناظرية thymidine 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) محل طريقة وضع العلامات على الحمض النووي 3H-thymidine المرهقة والمستهلكة للوقت وعالية الدقة وغير المتوافقة مع الفحص الدقيق لفحوصات تكاثر الخلايا 6,9. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تقنية وضع العلامات 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) بشكل متزايد على BrdU. ظهر هذا النمط لعدة أسباب. أولا ، طريقة BrdU بطيئة وكثيفة العمالة. ظروف المستخدم متغيرة ، وهي غير قادرة على الحفاظ على البنية التحتية في العينات (بسبب تمسخ الحمض النووي). وبالمثل ، تفقد طريقة BrdU مستضدية الخلايا ، مما يجعلها غير فعالة للتحليلات والمقايسات الوظيفية النهائية مثل تجارب التوطين المشترك وزرع الخلايا الجذعية في الجسم الحي 3،7،9،10،11،12. BrdU هو أيضا ماسخ ، وهو غير مناسب لوضع العلامات على LRCs في التطور الجنيني6. أيضا ، طريقة BrdU غير فعالة عند استخدامها في عينات التركيب الكامل. العيوب هي انخفاض تغلغل الأجسام المضادة في الجزء العميق من العينات أو شرط فترة حضانة طويلة للأجسام المضادة للاختراق العميق13. يهرب وضع العلامات EdU من خطوات تغيير طبيعة العينات ، وبالتالي الحفاظ على البنية التحتية. هذه الميزة مفيدة للتحليلات الوظيفية النهائية مثل تجارب التوطين المشترك وزرع الخلايا الجذعية11,12. أيضا ، وضع العلامات EdU حساسة للغاية وسريعة. تغلغل العينة مرتفع بسبب استخدام أزيدات الفلورسنت سريعة الامتصاص والأصغر حجما للكشف عن ملصقات EdU من خلال تفاعل الإضافة الحلقية المحفز بالنحاس (I) [3 + 2] (كيمياء “النقر)14.
طريقة أخرى لتصنيف الحمض النووي يتم تطبيقها بشكل متزايد هي استخدام الفئران المعدلة وراثيا المهندسة. تعبر هذه الفئران عن بروتين الفلورسنت الأخضر هيستون 2B (H2B-GFP) الذي يتحكم فيه عنصر منظم مستجيب للتتراسيكلين 5,14. بعد إطعام الفئران بتشاو / ماء التتراسيكلين لفترة مطاردة تتراوح من 4 أسابيع إلى 4 أشهر ، سوف يتضاءل مضان GFP في خلايا الدورة ويحتفظ LRCs فقط بالتألق6. ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن عزل مراكز مصادر التعلم الموسومة وتظل قابلة للحياة لزراعة الخلايا أو التحليلات الوظيفيةالنهائية 6,7. أبلغت بعض الدراسات عن وضع علامات غير دقيقة على الخلايا الجذعية الهادئة عند مطاردتها للاستخدام على المدى الطويل. كانت هذه النتيجة بسبب تعبير خلفية متسرب من سلالة H2B-GFP وليس الاستجابة المناسبة التي ينظمها التتراسيكلين15.
علاوة على ذلك ، استخدمت معظم الأدبيات في الماضي اكتشاف مراكز مصادر التعلم بشكل أساسي على شرائح مجزأة ، وهي ثنائية الأبعاد وغالبا ما تكون متحيزة بشكل خاطئ في إظهار الموقع الدقيق وعدد مراكز مصادر التعلم. أظهر النهج زوايا غير صحيحة لأقسام هياكل الأنسجة المعقدة16. كانت الطريقة الأخرى هي الحصول على صور 3D من الأقسام التسلسلية وإجراء عمليات إعادة بناء ما بعد الصورة. كانت هذه الخطوات غير دقيقة بسبب تشويه الصورة من الاختلافات في كل قسم تسلسلي بسبب الأقسام المضغوطة أو الممتدة ، مما أدى إلى فقدان المعلومات16،17،18. كانت الطريقة أيضا شاقة وتستغرق وقتا طويلا.
لتسهيل التصوير الكامل لمراكز مصادر التعلم ، يجب توضيح العينات مع الحفاظ على التألق جيدا. يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة الحالية إلى ثلاث فئات رئيسية: تقنيات إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية ، وتقنيات إزالة الأنسجة القائمة على الكاشف المائي ، وتقنيات إزالة الأنسجة القائمة على الهيدروجيل17،19. تم مؤخرا تطوير نظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEGASOS). هذا النهج يجعل جميع أنواع الأنسجة تقريبا شفافة ويحافظ على مضان داخلي المنشأ ، بما في ذلك الأنسجة الصلبة مثل العظام والأسنان20. تتميز طريقة PEGASOS بمزايا مقارنة بطرق إزالة الأنسجة الأخرى ، خاصة في إزالة مواد الأسنان والعظام. يمكن لمعظم الطرق الأخرى إزالة الأنسجة الصلبة جزئيا فقط ، أو لها أوقات معالجة طويلة ، أو تتطلب كواشف مكلفة21. أيضا ، يمكن لطريقة PEGASOS الحفاظ بكفاءة على التألق الداخلي على الطرق الأخرى.
قادتنا هذه الأدبيات إلى إنشاء طريقة جديدة لدراسة الخلايا. لقد جمعنا مزايا الكشف عن LRCs لوضع العلامات على EdU مع التصوير الأكثر تفوقا 3D الكامل للعينات التي تم تطهيرها من الأنسجة. تمت معالجة العينات باستخدام تقنية إزالة الأنسجة المتقدمة المرتبطة بنظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEGASOS)15. مكنتنا شفافية الأنسجة الصلبة من إعادة بناء إشارة 3D لتألق LRCs في الجسم الحي دون كسر الأسنان أو الفك السفلي ، مما يخلق طريقة أكثر دقة لتصور وقياس LRCs.
في هذه الدراسة ، نقدم دليلا مبتكرا لتصور LRCs في قاطعة الماوس. لقد صنعنا نهجا مرئيا 3D لتحديد موقع وكمية LRCs داخل مكانة الخلايا الجذعية القاطعة للفأر. استخدم هذا المشروع وضع العلامات على EdU ، وتقنيات إزالة الأنسجة PEGASOS ، والفحص المجهري متحد البؤر. تتغلب طريقتنا في وضع علامات EdU على LRCs على أنسجة كاملة التركيب واستخدام عينة واضحة وشفافة على كل من قيود الشرائح التقليدية المجزأة وغيرها من طرق وضع العلامات على الحمض النووي غير المواتية. وبالتالي ، ستكون تقنيتنا مناسبة للدراسات حول توازن الخلايا الجذعية التي تتطلب اكتشاف LRCs ، خاصة على الأنسجة الصلبة. يمكن أن يكون البروتوكول مفيدا بنفس القدر لأولئك الذين يركزون على الاتزان الداخلي للخلايا الجذعية في الأنسجة والأعضاء الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة ما تستخدم جرعات متعددة من الحقن (BrdU ، EdU) على الفئران الوليدية النامية لتسمية الخلايا المتكاثرة قدر الإمكان1،6،13. تعتبر فترة المطاردة خطوة حاسمة فيما يتعلق بمعدل تجديد الأنسجة 6,13. قاطعة الماوس تجدد نفس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ميغان ك. هولت على تحرير المخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح NIH / NIDCR DE026461 و DE028345 وتمويل بدء التشغيل من كلية طب الأسنان في تكساس إيه آند إم للدكتور شياو فانغ وانغ.
Materials
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
