Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo é um excelente modelo para o estudo de células-tronco adultas¹. As células-tronco epiteliais (alça cervical labial e lingual) e mesenquimais (entre a alça cervical labial e lingual) que residem na face proximal do incisivo diferenciam-se em ameloblastos, odontoblastos e células da polpa dentária. Este processo único fornece uma fonte de células para compensação da perda e turnover tecidual². Embora vários marcadores de células-tronco como Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1, etc. foram identificadas in vivo para os subgrupos de células-tronco adultas em incisivos de camundongos, que são inadequadas para representar as populações de células-tronco quando usadas isoladamente 1,3,4,5. A visualização de células quiescentes de vida longa por marcação e retenção de DNA análogo a nucleotídeos poderia fornecer detecção imparcial para a maioria dos subconjuntos de células-tronco adultas⁶. Além disso, essa abordagem é útil entre muitos métodos de identificação de células-tronco⁷ para entender o comportamento celular e a homeostase de populações de células-tronco dentárias ^3,8. Enquanto as células-tronco em divisão perderiam sua marcação de DNA após uma perseguição considerável, as supostas células-tronco quiescentes retêm seu rótulo de DNA, considerando-as células retentoras de marcação (LRCs)⁶. A marcação e retenção do DNA por células-tronco não em divisão marcará e localizará as células-tronco adultas putativas em seus nichos.

Nos últimos anos, a marcação com 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) análogo da timidina substituiu o método pesado, demorado e incompatível de marcação de DNA 3H-timidina por microscopia de alta resolução para ensaios de proliferação celular ^6,9. Nos últimos anos, a técnica de marcação com 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) tem sido cada vez mais utilizada em relação à BrdU. Esse padrão surgiu por vários motivos. Primeiro, o método BrdU é lento e trabalhoso. As condições do usuário são variáveis, e é incapaz de preservar a ultraestrutura nos espécimes (devido à desnaturação do DNA). Da mesma forma, o método BrdU perde a antigenicidade das células, tornando-o ineficiente para análises funcionais a jusante e ensaios como os experimentos de co-localização e transplante in vivo de células-tronco 3,7,9,10,11,12. O BrdU também é um teratógeno, que não é adequado para marcação de LRCs no desenvolvimento embrionário⁶. Além disso, o método BrdU é ineficiente quando usado em amostras de montagem inteira. As desvantagens são a baixa penetração de anticorpos na parte profunda dos espécimes ou a necessidade de um longo período de incubação de anticorpos para penetração profunda¹³. A marcação EdU escapa das etapas de desnaturação dos espécimes, preservando assim a ultraestrutura. Essa característica é vantajosa para análises funcionais a jusante, como experimentos de co-localização e transplante de células-tronco^11,12. Além disso, a marcação EdU é altamente sensível e rápida; A penetração do espécime é alta devido ao uso de azidas fluorescentes de menor tamanho e rápida absorção para detecção de etiquetas de EdU através de uma reação de cicloadição [3 + 2] catalisada por(I) (“química de clique”)¹⁴.

Outro método de marcação de DNA cada vez mais aplicado é o uso de camundongos transgênicos modificados. Esses camundongos expressam a proteína fluorescente verde da histona 2B (H2B-GFP) controlada por um elemento regulador responsivo à tetraciclina ^5,14. Depois de alimentar camundongos com ração/água de tetraciclina por um período de perseguição de 4 semanas a 4 meses, a fluorescência da GFP diminuirá nas células cicladoras e apenas as LRCs reterão a fluorescência⁶. A vantagem desse método é que as LRCs marcadas podem ser isoladas e permanecem viáveis para cultura celular ou análises funcionais a jusante ^6,7. Alguns estudos relataram marcação imprecisa de células-tronco quiescentes quando perseguidas para uso a longo prazo. Esse resultado foi devido a uma expressão de fundo vazada da cepa H2B-GFP e não à resposta apropriada regulada por tetraciclina¹⁵.

Além disso, a maioria da literatura no passado usava a detecção de LRCs principalmente em lâminas seccionadas, que são bidimensionais e muitas vezes erroneamente enviesadas para mostrar a localização precisa e o número de LRCs. A abordagem mostrou ângulos incorretos para cortes de estruturas teciduais complexas¹⁶. O outro método foi obter imagens 3D a partir de cortes seriados e realizar reconstruções pós-imagem. Esses passos foram imprecisos devido à distorção da imagem a partir de variações em cada corte seriado devido a cortes comprimidos ou esticados, resultando em informações ausentes^16,17,18. O método também era trabalhoso e demorado.

Para facilitar a obtenção de imagens de montagem completa de LRCs, as amostras precisam ser esclarecidas enquanto a fluorescência é bem mantida. As técnicas atuais de limpeza de tecidos podem ser classificadas em três grandes categorias: técnicas de limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos, técnicas de limpeza de tecidos à base de reagentes aquosos e técnicas de limpeza de tecidos à base de hidrogel^17,19. O sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS) foi recentemente desenvolvido. Essa abordagem torna quase todos os tipos de tecidos transparentes e preserva a fluorescência endógena, incluindo tecidos duros, como osso e dentes²⁰. O método PEGASOS apresenta vantagens sobre outros métodos de limpeza tecidual, especialmente na limpeza de materiais dentários e ósseos. A maioria dos outros métodos poderia limpar apenas parcialmente tecidos duros, ter longos tempos de processamento ou exigir reagentes dispendiosos²¹. Além disso, o método PEGASOS pode preservar eficientemente a fluorescência endógena em relação a outros métodos.

Essa literatura nos levou a criar um novo método para o estudo celular. Combinamos as vantagens de detecção de LRCs da marcação de EdU com a imagem 3D de montagem completa mais superior de espécimes desembaraçados de tecido; amostras foram processadas com técnica avançada de limpeza tecidual do sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS)¹⁵. A transparência do tecido duro nos permitiu reconstruir o sinal 3D da fluorescência das LRCs in vivo sem quebrar os dentes ou a mandíbula, criando uma maneira mais precisa de visualizar e quantificar as LRCs.

Neste estudo, fornecemos um guia inovador para visualização de LRCs no incisivo de camundongos. Fizemos uma abordagem visual 3D para determinar a localização e a quantidade de LRCs dentro do nicho de células-tronco incisivas de camundongos. Este projeto utilizou marcação com EdU, técnicas de limpeza tecidual PEGASOS e microscopia confocal. Nosso método de marcação de EdU as LRCs em tecido montado inteiro e o uso de um espécime limpo e transparente superam as limitações das lâminas seccionadas tradicionais e outros métodos desvantajosos de marcação de DNA. Assim, nossa técnica será adequada para estudos sobre homeostase de células-tronco que necessitem de detecção de LRCs, especialmente em tecidos duros. O protocolo pode ser igualmente vantajoso para aqueles que enfocam a homeostase de células-tronco em outros tecidos e órgãos.