זיהוי וכימות של תאים שומרי תוויות בחותכות עכבר באמצעות גישת שחזור תלת-ממדית לאחר ניקוי רקמות

החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף היא מודל מצוין לחקר תאי גזע בוגרים¹. תאי הגזע האפיתל (לולאה צווארית שפתית ולשונית) ותאי גזע מזנכימליים (בין הלולאה הצווארית השפתית והלשונית) השוכנים בצד הפרוקסימלי של החותכת מתמיינים לאמלובלסטים, אודונטובלסטים ותאי מוך השן. תהליך ייחודי זה מספק מקור תאים לפיצוי אובדן רקמות ותחלופת רקמה². למרות מספר סמנים של תאי גזע כגון Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 וכו ‘. זוהו in vivo עבור תת-קבוצות של תאי גזע בוגרים בחותכות עכבר, הם אינם מספיקים בייצוג אוכלוסיות תאי הגזע כאשר משתמשים בהם לבד 1,3,4,5. הדמיה של תאים שקטים מאריכי חיים על ידי תיוג ושימור דנ”א אנלוגי של נוקלאוטידים יכולה לספק זיהוי בלתי משוחד עבור רוב תת-הקבוצות של תאי גזע בוגרים⁶. יתר על כן, גישה זו שימושית בקרב שיטות זיהוי תאי גזע רבות⁷ להבנת התנהגות התאים והומאוסטזיס של אוכלוסיות תאי גזע דנטליים ^3,8. בעוד שתאי הגזע המתחלקים יאבדו את תיוג הדנ”א שלהם לאחר מרדף ניכר, תאי הגזע השקטים לכאורה שומרים על תווית הדנ”א שלהם, ורואים בהם תאים שומרי תוויות (LRCs)⁶. תיוג ושימור DNA על ידי תאי גזע שאינם מתחלקים יסמנו וימקמו את תאי הגזע הבוגרים לכאורה בנישות שלהם.

במהלך השנים האחרונות, תיוג אנלוגי של תימידין 5-ברומו-2′-דאוקסיורידין (BrdU) החליף את שיטת התיוג 3H-thymidine DNA המסורבלת, הגוזלת זמן רב וברזולוציה גבוהה שאינה תואמת 3H-thymidine DNA לבדיקות התפשטות תאים ^6,9. בשנים האחרונות, טכניקת התיוג 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) נמצאת בשימוש הולך וגובר על BrdU. דפוס זה נוצר מכמה סיבות. ראשית, שיטת BrdU היא איטית ועתירת עבודה. תנאי המשתמש משתנים, והוא אינו מסוגל לשמר את מבנה העל בדגימות (עקב דנטורציה של DNA). כמו כן, שיטת BrdU מאבדת את האנטיגניות של תאים, ובכך הופכת אותה ללא יעילה עבור ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם ובדיקות כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU הוא גם טרטוגן, שאינו מתאים לתיוג LRCs בהתפתחות עוברית⁶. כמו כן, שיטת BrdU אינה יעילה כאשר משתמשים בה בדגימות שלמות. החסרונות הם חדירה נמוכה של נוגדנים בחלק העמוק של הדגימות או דרישה לתקופת דגירה ארוכה של נוגדנים לחדירה עמוקה¹³. תיוג EdU חומק מהשלבים של דגימות דנטורציה, ובכך משמר את מבנה העל. תכונה זו מועילה לניתוחים פונקציונליים במורד הזרם, כגון ניסויי לוקליזציה משותפת והשתלת תאי גזע^11,12. כמו כן, תיוג EdU רגיש ומהיר מאוד; חדירת הדגימות גבוהה הודות לשימוש באזידים פלואורסצנטיים נספגים במהירות ובגודל קטן יותר לזיהוי תוויות EdU באמצעות תגובת ציקלואיד (כימיית “קליק” Cu(I)-זרז [3 + 2]¹⁴.

שיטה נוספת לסימון דנ”א המיושמת יותר ויותר היא השימוש בעכברים טרנסגניים מהונדסים. עכברים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק היסטון 2B (H2B-GFP) הנשלט על ידי אלמנט מווסת מגיב טטרציקלין ^5,14. לאחר האכלת עכברים בטטרציקלין צ’או/מים למשך תקופת מרדף של 4 שבועות עד 4 חודשים, פלואורסצנטיות GFP תפחת בתאי מחזור ורק LRCs ישמרו על פלואורסצנטיות⁶. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לבודד את ה- LRCs המסומנים ולהישאר בני קיימא עבור תרבית תאים או ניתוחים פונקציונליים במורד הזרם ^6,7. כמה מחקרים דיווחו על תיוג לא מדויק של תאי גזע שקטים כאשר רדפו אחריהם לשימוש ארוך טווח. תוצאה זו נבעה מביטוי רקע דולף מזן H2B-GFP ולא מהתגובה המווסתת הטטרציקלין^{המתאימה 15}.

יתר על כן, רוב הספרות בעבר השתמשה בזיהוי LRCs בעיקר על שקופיות חתוכות, שהן דו-ממדיות ולעתים קרובות מוטות בטעות בהצגת המיקום והמספר המדויקים של LRCs. הגישה הציגה זוויות שגויות למקטעים של מבני רקמות מורכבים¹⁶. השיטה השנייה הייתה להשיג תמונות תלת ממדיות מקטעים טוריים ולבצע שחזורים לאחר התמונה. שלבים אלה לא היו מדויקים בגלל עיוות תמונה מווריאציות בכל קטע טורי עקב קטעים דחוסים או מתוחים, וכתוצאה מכך חסר מידע^16,17,18. השיטה הייתה גם מייגעת וגוזלת זמן.

כדי להקל על הדמיה מלאה של LRCs, הדגימות צריכות להיות ברורות בזמן שהפלואורסצנטיות מתוחזקת היטב. ניתן לסווג את טכניקות ניקוי הרקמה הנוכחיות לשלוש קטגוריות עיקריות: טכניקות ניקוי רקמות מבוססות ממס אורגני, טכניקות ניקוי רקמות מבוססות מגיב מימי, וטכניקות ניקוי רקמות מבוססות הידרוג’ל^17,19. מערכת הממסים הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG) (פגסוס) פותחה לאחרונה. גישה זו הופכת כמעט את כל סוגי הרקמות לשקופים ומשמרת פלואורסצנטיות אנדוגנית, כולל רקמות קשות כגון עצם ושיניים²⁰. לשיטת פגסוס יתרונות על פני שיטות ניקוי רקמות אחרות, בעיקר בניקוי חומרי שן ועצם. רוב השיטות האחרות יכולות לנקות רקמות קשות רק באופן חלקי, בעלות זמני עיבוד ארוכים, או דורשות ריאגנטים יקרים²¹. כמו כן, שיטת פגסוס יכולה לשמר ביעילות פלואורסצנטיות אנדוגנית על פני שיטות אחרות.

ספרות זו הובילה אותנו ליצור שיטה חדשה לחקר התא. שילבנו את יתרונות זיהוי ה-LRCs של תיוג EdU עם ההדמיה התלת-ממדית המעולה ביותר של דגימות שעברו ניקוי רקמות; הדגימות עובדו בטכניקת ניקוי רקמות מתקדמת של מערכת ממס משויכת פוליאתילן גליקול (PEG) (PEGASOS)¹⁵. שקיפות רקמות קשות אפשרה לנו לשחזר את האות התלת-ממדי של פלואורסצנטיות LRCs in vivo מבלי לשבור את השיניים או הלסתות, וליצור דרך מדויקת יותר לדמיין ולכמת LRCs.

במחקר זה, אנו מספקים מדריך חדשני להמחשת LRCs בחותך העכבר. יצרנו גישה חזותית תלת-ממדית כדי לקבוע את המיקום והכמות של LRCs בתוך נישת תאי הגזע החותכים לעכבר. פרויקט זה השתמש בתיוג EdU, טכניקות ניקוי רקמות פגסוס ומיקרוסקופ קונפוקלי. השיטה שלנו של תיוג EdU של LRCs על רקמה שלמה ושימוש בדגימה מנוקה ושקופה מתגברת הן על המגבלות של שקופיות חתוכות מסורתיות והן על שיטות תיוג DNA חסרות אחרות. לכן, הטכניקה שלנו תתאים למחקרים על הומאוסטזיס של תאי גזע הדורשים זיהוי LRCs, במיוחד על רקמות קשות. הפרוטוקול יכול להיות מועיל באותה מידה לאלה המתמקדים בהומאוסטזיס של תאי גזע ברקמות ואיברים אחרים.