Doku Temizliğinden Sonra 3D Rekonstrüksiyon Yaklaşımı Kullanılarak Fare Kesici Dişlerinde Etiket Tutan Hücrelerin Tespiti ve Kantitasyonu
Summary
Fare kesicisi, kök hücre nişinde değerli etiket tutucu hücreler içerir. Etiket tutucu hücreleri tarafsız bir şekilde tespit etmek ve ölçmek için yeni bir yolumuz var; Çalışmamızda EdU etiketleme ve PEGASOS dokusunun mandibuladan temizlenmesinden sonra 3D rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır.
Abstract
Murin kesici, farenin ömrü boyunca sürekli büyüyen bir organdır. Kesici dişlerin proksimal dokularında bulunan epitel ve mezenkimal kök hücreler, ameloblastlara, odontoblastlara ve pulpa fibroblastlarına farklılaşacak döllere yol açar. Bu hücreler, kesici dokuların sürekli cirosunu desteklemede çok önemlidir, bu da murin kesicisini yetişkin kök hücrelerin homeostazını incelemek için mükemmel bir model haline getirir. Kök hücrelerin, 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) gibi nükleotid analogları ile etiketlenebilen uzun ömürlü sessiz hücreler içerdiğine inanılmaktadır. Hücreler zaman içinde bu etiketi korur ve buna göre etiket tutma hücreleri (LRC’ler) olarak adlandırılır. LRC’leri in vivo görselleştirmeye yönelik yaklaşımlar, kök hücre homeostazını izlemek için sağlam bir araç sağlar. Bu çalışmada, LRC’leri görselleştirmek ve analiz etmek için bir yöntem tanımladık. Yenilikçi yaklaşımımız, doku temizleme ve tam montajlı EdU boyama işleminden sonra fare kesici dişlerinde LRC’leri, ardından konfokal mikroskopiyi ve görüntüleme yazılımı ile 3 boyutlu (3D) bir rekonstrüksiyonu içerir. Bu yöntem, kesitli slaytlar üzerindeki geleneksel LRC analizine kıyasla 3D görüntüleme elde etmeyi ve önyargısız kantitasyonu mümkün kılar.
Introduction
Sürekli büyüyen fare kesici ucu, yetişkin kök hücreleri incelemek için mükemmel bir modeldir1. Kesici dişin proksimal tarafında bulunan epitel (labial ve lingual servikal loop) ve mezenkimal kök hücreler (labial ve lingual servikal loop arasında) ameloblastlara, odontoblastlara ve diş pulpası hücrelerine farklılaşır. Bu eşsiz süreç, doku kaybının ve cironun telafisi için bir hücre kaynağı sağlar2. Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 gibi birkaç kök hücre belirteci olmasına rağmen. fare kesici dişlerinde yetişkin kök hücrelerin alt kümeleri için in vivo olarak tanımlanmıştır, tek başına kullanıldığında kök hücre popülasyonlarını temsil etmede yetersizdir 1,3,4,5. Uzun ömürlü sessiz hücrelerin nükleotid analog DNA etiketleme ve retansiyonu ile görselleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin çoğu alt kümesi için tarafsız tespit sağlayabilir6. Ayrıca, bu yaklaşım birçok kök hücre tanımlama yöntemiarasında yararlıdır 7 hücre davranışını ve diş kök hücre popülasyonlarının homeostazını anlamak için 3,8. Bölünen kök hücreler kayda değer bir kovalamacadan sonra DNA etiketlerini kaybederken, varsayılan sessiz kök hücreler DNA etiketlerini korur ve onları etiket tutucu hücreler (LRC’ler) olarak kabul eder6. Bölünmeyen kök hücreler tarafından DNA etiketlemesi ve tutulması, varsayılan yetişkin kök hücreleri nişlerinde işaretleyecek ve bulacaktır.
Son yıllarda, timidin analog 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) etiketlemesi, hücre proliferasyon testleri 6,9 için hantal, zaman alıcı ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi uyumsuz 3H-timidin DNA etiketleme yönteminin yerini almıştır. Son yıllarda, 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) etiketleme tekniği BrdU üzerinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu model birkaç nedenden dolayı ortaya çıkmıştır. İlk olarak, BrdU yöntemi yavaş ve emek yoğundur. Kullanıcı koşulları değişkendir ve örneklerdeki ultrayapıyı koruyamaz (DNA denatürasyonu nedeniyle). Benzer şekilde, BrdU yöntemi hücrelerin antijenitesini kaybeder, böylece ko-lokalizasyon deneyleri ve in vivo kök hücrenakli 3,7,9,10,11,12 gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri ve tahlilleri için verimsiz hale getirir. BrdU ayrıca embriyonik gelişim6’da LRC’leri etiketlemek için uygun olmayan bir teratojendir. Ayrıca, BrdU yöntemi tüm montajlı numunelerde kullanıldığında verimsizdir. Dezavantajları, numunelerin derin kısmında antikorların düşük penetrasyonu veya derin penetrasyon için uzun bir antikor inkübasyon süresinin gerekliliğidir13. EdU etiketleme, numunelerin denatüre edilmesi adımlarından kaçar, böylece ultra yapıyı korur. Bu özellik, ko-lokalizasyon deneyleri ve kök hücre nakli gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri için avantajlıdır11,12. Ayrıca, EdU etiketleme son derece hassas ve hızlıdır; EdU etiketlerini Cu(I)-katalizli [3 + 2] sikloekleme reaksiyonu (“tıklama” kimyası)14 yoluyla tespit etmek için hızla emilen ve daha küçük boyutlu floresan azidlerin kullanılması nedeniyle numune penetrasyonu yüksektir.
Giderek daha fazla uygulanan bir diğer DNA etiketleme yöntemi, mühendislik ürünü transgenik farelerin kullanılmasıdır. Bu fareler, tetrasikline duyarlı bir düzenleyici element 5,14 tarafından kontrol edilen histon 2B yeşil floresan proteinini (H2B-GFP) eksprese eder. Fareleri 4 haftalık ila 4 aylık bir kovalama süresi boyunca tetrasiklin chow / su ile besledikten sonra, GFP floresansı döngü hücrelerinde azalacak ve sadece LRC’ler floresan6’yı koruyacaktır. Bu yöntemin avantajı, etiketli LRC’lerin izole edilebilmesi ve hücre kültürü veya aşağı akış fonksiyonel analizleri için uygun kalmasıdır 6,7. Bazı çalışmalar, uzun süreli kullanım için kovalandığında sessiz kök hücrelerin yanlış etiketlendiğini bildirmiştir. Bu sonuç, H2B-GFP suşundan sızan bir arka plan ifadesinden kaynaklanıyordu ve uygun tetrasiklin tarafından düzenlenmiş yanıttankaynaklanmıyordu15.
Dahası, geçmişte çoğu literatür LRC’lerin tespitini esas olarak iki boyutlu olan ve LRC’lerin doğru yerini ve sayısını göstermede genellikle hatalı bir şekilde önyargılı olan kesitli slaytlarda kullanmıştır. Yaklaşım, karmaşık doku yapılarının kesitleri için yanlış açılar gösterdi16. Diğer yöntem ise seri kesitlerden 3D görüntüler elde etmek ve görüntü sonrası rekonstrüksiyonlar yapmaktı. Bu adımlar, sıkıştırılmış veya gerilmiş bölümler nedeniyle her seri bölümdeki varyasyonlardan kaynaklanan görüntü bozulması nedeniyle yanlıştı ve eksik bilgilere neden oldu16,17,18. Yöntem aynı zamanda zahmetli ve zaman alıcıydı.
LRC’lerin tam montajlı görüntülemesini kolaylaştırmak için, floresan iyi korunurken numunelerin netleştirilmesi gerekir. Güncel doku temizleme teknikleri üç ana kategoriye ayrılabilir: organik solvent bazlı doku temizleme teknikleri, sulu reaktif bazlı doku temizleme teknikleri ve hidrojel bazlı doku temizleme teknikleri17,19. Polietilen glikol (PEG) ile ilişkili çözücü sistemi (PEGASOS) yakın zamanda geliştirilmiştir. Bu yaklaşım neredeyse tüm doku tiplerini şeffaf hale getirir ve kemik ve dişler gibi sert dokular da dahil olmak üzere endojen floresanı korur20. PEGASOS yönteminin özellikle diş ve kemik materyallerinin temizlenmesinde diğer doku temizleme yöntemlerine göre avantajları vardır. Diğer yöntemlerin çoğu sert dokuları yalnızca kısmen temizleyebilir, uzun işlem sürelerine sahip olabilir veya maliyetli reaktifler gerektirebilir21. Ayrıca, PEGASOS yöntemi endojen floresanı diğer yöntemlere göre etkili bir şekilde koruyabilir.
Bu literatür bizi hücre çalışması için yeni bir yöntem oluşturmaya yönlendirdi. EdU etiketlemenin LRC’lerin algılama avantajlarını, dokudan arındırılmış numunelerin en üstün 3D tam montajlı görüntülemesiyle birleştirdik; Numuneler gelişmiş polietilen glikol (PEG) ile ilişkili solvent sistemi (PEGASOS) doku temizleme tekniği15 ile işlenmiştir. Sert doku saydamlığı, LRC’lerin floresansının 3D sinyalini dişleri veya mandibulayı kırmadan in vivo olarak yeniden yapılandırmamızı sağladı ve LRC’leri görselleştirmek ve ölçmek için daha doğru bir yol yarattı.
Bu çalışmada, fare kesici dişindeki LRC’leri görselleştirmek için yenilikçi bir kılavuz sunuyoruz. LRC’lerin fare kesici kök hücre nişi içindeki yerini ve miktarını belirlemek için 3D görsel bir yaklaşım yaptık. Bu projede EdU etiketleme, PEGASOS doku temizleme teknikleri ve konfokal mikroskopi kullanılmıştır. LRC’leri tüm montajlı doku üzerinde etiketleme ve temizlenmiş ve şeffaf bir numunenin kullanılması yöntemimiz, hem geleneksel kesitli slaytların hem de diğer dezavantajlı DNA etiketleme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelir. Bu nedenle tekniğimiz, özellikle sert dokularda LRC tespiti gerektiren kök hücre homeostazı çalışmaları için uygun olacaktır. Protokol, diğer doku ve organlardaki kök hücre homeostazına odaklananlar için eşit derecede avantajlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çoklu enjeksiyon dozları (BrdU, EdU) genellikle çoğalan hücreleri mümkün olduğunca etiketlemek için büyüyen yenidoğan farelerde kullanılır 1,6,13. Kovalama süresi, dokuların yenilenme hızı açısından kritik bir adım olarak kabul edilir 6,13. Fare kesici ucu her ay kendini yeniler. Bu özellik, araştırmacıların kovalama süresini 4 hafta<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Meghann K. Holt’a makaleyi düzenlediği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH / NIDCR hibeleri DE026461 ve DE028345 ve Texas A &M Diş Hekimliği Fakültesi’nden Dr. Xiaofang Wang’a başlangıç fonu ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
