Detektion und Quantifizierung von markierungshaltenden Zellen in Schneidezähnen von Mäusen mittels eines 3D-Rekonstruktionsansatzes nach Gewebereinigung

Der kontinuierlich wachsende Schneidezahn der Maus ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung adulter Stammzellen¹. Die epithelialen (labiale und linguale zervikale Schleife) und mesenchymalen Stammzellen (zwischen der labialen und lingualen zervikalen Schleife), die sich auf der proximalen Seite des Schneidezahns befinden, differenzieren sich in Ameloblasten, Odontoblasten und Zahnpulpazellen. Dieser einzigartige Prozess bietet eine Zellquelle zur Kompensation von Gewebeverlust und -umsatz². Obwohl mehrere Stammzellmarker wie Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 usw. in vivo für die Untergruppen adulter Stammzellen in Schneidezähnen von Mäusen identifiziert wurden, sind sie bei alleiniger Anwendung nicht ausreichend, um die Stammzellpopulationen darzustellen 1,3,4,5. Die Visualisierung langlebiger ruhender Zellen durch nukleotidanaloge DNA-Markierung und -Retention könnte einen unverzerrten Nachweis für die meisten Untergruppen adulter Stammzellen ermöglichen⁶. Darüber hinaus ist dieser Ansatz unter vielen Stammzellidentifikationsmethoden⁷ nützlich, um das Zellverhalten und die Homöostase von dentalen Stammzellpopulationen^{zu verstehen 3,8}. Während die sich teilenden Stammzellen nach einer längeren Verfolgungsjagd ihre DNA-Markierung verlieren würden, behalten die mutmaßlich ruhenden Stammzellen ihre DNA-Markierung bei, was sie als markierungserhaltende Zellen (LRCs) ^bezeichnet6. Die DNA-Markierung und -Retention durch sich nicht teilende Stammzellen markiert und lokalisiert die mutmaßlichen adulten Stammzellen in ihren Nischen.

In den letzten Jahren ersetzte die Markierung mit dem Thymidin-Analogon 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) die umständliche, zeitaufwändige und hochauflösende, mikroskopisch inkompatible 3H-Thymidin-DNA-Markierungsmethode für Zellproliferationsassays ^6,9. In den letzten Jahren wurde die 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin (EdU)-Markierungstechnik zunehmend über BrdU verwendet. Dieses Muster entstand aus mehreren Gründen. Erstens ist die BrdU-Methode langsam und arbeitsintensiv. Die Benutzerbedingungen sind variabel, und es ist nicht in der Lage, die Ultrastruktur in Proben zu erhalten (aufgrund der DNA-Denaturierung). Ebenso verliert die BrdU-Methode die Antigenität von Zellen, was sie für nachgelagerte funktionelle Analysen und Assays wie die Co-Lokalisationsexperimente und die In-vivo-Stammzelltransplantation ^ineffizient macht 3,7,9,10,11,12. BrdU ist auch ein Teratogen, das nicht für die Markierung von LRCs in der Embryonalentwicklung geeignet ist⁶. Außerdem ist die BrdU-Methode ineffizient, wenn sie in den Proben mit ganzer Montage verwendet wird. Die Nachteile sind eine geringe Penetration von Antikörpern im tiefen Teil der Proben oder die Notwendigkeit einer langen Antikörperinkubationszeit für eine tiefe Penetration¹³. Die EdU-Markierung entgeht den Schritten der Denaturierung von Proben, wodurch die Ultrastruktur erhalten bleibt. Diese Eigenschaft ist vorteilhaft für nachgelagerte funktionelle Analysen wie Co-Lokalisationsexperimente und Stammzelltransplantationen^11,12. Außerdem ist die EdU-Kennzeichnung hochempfindlich und schnell; Die Probenpenetration ist aufgrund der Verwendung von schnell absorbierten und kleineren fluoreszierenden Aziden zum Nachweis von EdU-Markierungen durch eine Cu(I)-katalysierte [3 + 2] Cycloadditionsreaktion (“Klick”-Chemie) ^hoch14.

Eine weitere zunehmend angewandte DNA-Markierungsmethode ist die Verwendung von gentechnisch veränderten transgenen Mäusen. Diese Mäuse exprimieren das grün fluoreszierende Histon-2B-Protein (H2B-GFP), das durch ein Tetracyclin-responsives Regulatorelement ^5,14 gesteuert wird. Nach der Fütterung von Mäusen mit Tetracyclin-Futter/Wasser für eine 4-wöchige bis 4-monatige Jagdperiode nimmt die GFP-Fluoreszenz in zyklischen Zellen ab und nur LRCs behalten die Fluoreszenz⁶. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die markierten LRCs isoliert werden können und für Zellkulturen oder nachgeschaltete funktionelle Analysen lebensfähig bleiben ^6,7. Einige Studien berichteten über eine ungenaue Markierung ruhender Stammzellen, wenn sie für den Langzeitgebrauch gejagt wurden. Dieses Ergebnis war auf eine undichte Hintergrundexpression des H2B-GFP-Stammes und nicht auf die entsprechende Tetracyclin-regulierte Reaktion^{zurückzuführen 15}.

Darüber hinaus wurde in der Literatur in der Vergangenheit die LRC-Erkennung hauptsächlich auf Schnittobjektträgern verwendet, die zweidimensional sind und oft fälschlicherweise die genaue Position und Anzahl der LRCs anzeigen. Der Ansatz zeigte falsche Winkel für Schnitte komplexer Gewebestrukturen¹⁶. Die andere Methode bestand darin, 3D-Bilder aus seriellen Schnitten zu erhalten und Rekonstruktionen nach dem Bild durchzuführen. Diese Schritte waren aufgrund von Bildverzerrungen durch Variationen in jedem seriellen Abschnitt aufgrund komprimierter oder gestreckter Abschnitte ungenau, was zu fehlenden Informationen führte^16,17,18. Die Methode war auch mühsam und zeitaufwändig.

Um die Whole-Mount-Bildgebung von LRCs zu erleichtern, müssen die Proben klar gemacht werden, während die Fluoreszenz gut erhalten bleibt. Aktuelle Gewebereinigungstechniken können in drei Hauptkategorien eingeteilt werden: Gewebereinigungstechniken auf der Basis organischer Lösungsmittel, Gewebereinigungstechniken auf der Basis von wässrigen Reagenzien und Gewebereinigungstechniken auf Hydrogelbasis^17,19. Das Polyethylenglykol (PEG)-assoziierte Lösungsmittelsystem (PEGASOS) wurde kürzlich entwickelt. Dieser Ansatz macht nahezu alle Arten von Geweben transparent und bewahrt die endogene Fluoreszenz, einschließlich harter Gewebe wie Knochen und Zähne²⁰. Die PEGASOS-Methode hat Vorteile gegenüber anderen Gewebereinigungsmethoden, insbesondere bei der Reinigung von Zahn- und Knochenmaterialien. Die meisten anderen Methoden konnten hartes Gewebe nur teilweise entfernen, haben lange Verarbeitungszeiten oder erfordern kostspielige Reagenzien²¹. Außerdem kann die PEGASOS-Methode die endogene Fluoreszenz gegenüber anderen Methoden effizient erhalten.

Diese Literatur führte uns dazu, eine neue Methode für die Zellstudie zu entwickeln. Wir kombinierten die LRC-Detektionsvorteile der EdU-Markierung mit der überlegensten 3D-Ganzkörperbildgebung von gewebegereinigten Proben. Die Proben wurden mit der fortschrittlichen Gewebereinigungstechnik des Polyethylenglykol (PEG)-assoziierten Lösungsmittelsystems (PEGASOS) verarbeitet¹⁵. Die Transparenz von Hartgewebe ermöglichte es uns, das 3D-Signal der LRC-Fluoreszenz in vivo zu rekonstruieren, ohne die Zähne oder den Unterkiefer zu brechen, wodurch eine genauere Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von LRCs geschaffen wurde.

In dieser Studie bieten wir einen innovativen Leitfaden zur Visualisierung von LRCs im Mausschneidezahn. Wir haben einen visuellen 3D-Ansatz entwickelt, um die Position und Menge der LRCs in der Stammzellnische der Mausschneidezähne zu bestimmen. In diesem Projekt wurden EdU-Markierung, PEGASOS-Gewebereinigungstechniken und konfokale Mikroskopie verwendet. Unsere Methode der EdU-Markierung der LRCs auf Whole-Mount-Gewebe und die Verwendung einer gereinigten und transparenten Probe überwindet sowohl die Einschränkungen herkömmlicher Objektträger als auch anderer nachteiliger DNA-Markierungsmethoden. Daher eignet sich unsere Technik für Studien zur Stammzellhomöostase, die den Nachweis von LRCs erfordern, insbesondere an hartem Gewebe. Das Protokoll kann für diejenigen, die sich auf die Stammzellhomöostase in anderen Geweben und Organen konzentrieren, gleichermaßen vorteilhaft sein.