Detectie en kwantificering van labelvasthoudende cellen in muizensnijtanden met behulp van een 3D-reconstructiebenadering na weefselverwijdering

De continu groeiende muizensnijtand is een uitstekend model voor het bestuderen van volwassen stamcellen¹. De epitheliale (labiale en linguale cervicale lus) en mesenchymale stamcellen (tussen de labiale en linguale cervicale lus) die zich aan de proximale kant van de snijtand bevinden, differentiëren in ameloblasten, odontoblasten en tandpulpcellen. Dit unieke proces biedt een bron van cellen voor compensatie van weefselverlies en omzet². Hoewel verschillende stamcelmarkers zoals Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, enz. in vivo zijn geïdentificeerd voor de subgroepen van volwassen stamcellen in muizensnijtanden, zijn zij ontoereikend om de stamcelpopulaties weer te geven wanneer zij alleen worden gebruikt 1,3,4,5. Het visualiseren van langlevende rustcellen door nucleotide analoge DNA-labeling en -retentie zou onbevooroordeelde detectie kunnen bieden voor de meeste subsets van volwassen stamcellen⁶. Verder is deze benadering nuttig bij veel stamcelidentificatiemethoden⁷ voor het begrijpen van celgedrag en de homeostase van tandheelkundige stamcelpopulaties ^3,8. Terwijl de delende stamcellen na een aanzienlijke achtervolging hun DNA-labeling zouden verliezen, behouden de vermeende rustige stamcellen hun DNA-label en beschouwen ze ze als label-retaining cells (LRC’s)⁶. DNA-etikettering en -retentie door niet-delende stamcellen zal de vermeende volwassen stamcellen in hun niches markeren en lokaliseren.

In de afgelopen jaren heeft thymidine analoge 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) etikettering de omslachtige, tijdrovende en hoge resolutie microscopie incompatibele 3H-thymidine DNA etiketteringsmethode voor celproliferatie assays ^6,9 vervangen. In de afgelopen jaren is de 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) etiketteringstechniek steeds vaker gebruikt dan BrdU. Dit patroon ontstond om verschillende redenen. Ten eerste is de BrdU-methode traag en arbeidsintensief. De gebruikersomstandigheden zijn variabel en het is niet in staat om de ultrastructuur in monsters te behouden (vanwege DNA-denaturatie). Evenzo verliest de BrdU-methode de antigeniciteit van cellen, waardoor deze inefficiënt wordt voor downstream functionele analyses en assays zoals de co-lokalisatie-experimenten en in vivo stamceltransplantatie 3,7,9,10,11,12. BrdU is ook een teratogeen, dat niet geschikt is voor het labelen van LRC’s in embryonale ontwikkeling⁶. Ook is de BrdU-methode inefficiënt wanneer deze wordt gebruikt in de monsters met een hele montage. De nadelen zijn een lage penetratie van antilichamen in het diepe deel van monsters of de vereiste van een lange incubatietijd van antilichamen voor diepe penetratie¹³. EdU-etikettering ontsnapt aan de stappen van denaturerende exemplaren, waardoor de ultrastructuur behouden blijft. Deze functie is voordelig voor downstream functionele analyses zoals co-lokalisatie-experimenten en stamceltransplantatie^11,12. Ook is EdU-etikettering zeer gevoelig en snel; de penetratie van monsters is hoog vanwege het gebruik van snel geabsorbeerde en kleinere fluorescerende aziden voor het detecteren van EdU-labels via een Cu(I)-gekatalyseerde [3 + 2] cycloadditiereactie (“klik”-chemie)¹⁴.

Een andere steeds meer toegepaste DNA-etiketteringsmethode is het gebruik van gemanipuleerde transgene muizen. Deze muizen drukken histon 2B groen fluorescerend eiwit (H2B-GFP) uit, gecontroleerd door een tetracycline-responsief regulatorelement ^5,14. Na het voeden van muizen met tetracycline chow / water gedurende een achtervolgingsperiode van 4 weken tot 4 maanden, zal de GFP-fluorescentie afnemen in cyclische cellen en behouden alleen LRC’s de fluorescentie⁶. Het voordeel van deze methode is dat de gelabelde LRC’s kunnen worden geïsoleerd en levensvatbaar blijven voor celkweek of downstream functionele analyses ^6,7. Sommige studies meldden onnauwkeurige etikettering van rustige stamcellen wanneer ze werden achtervolgd voor langdurig gebruik. Dit resultaat was te wijten aan een lekkende achtergrondexpressie van de H2B-GFP-stam en niet aan de juiste tetracycline-gereguleerde respons¹⁵.

Bovendien gebruikte de meeste literatuur in het verleden de detectie van LRC’s voornamelijk op doorsnededia’s, die tweedimensionaal zijn en vaak ten onrechte bevooroordeeld bij het weergeven van de nauwkeurige locatie en het aantal LRC’s. De benadering toonde onjuiste hoeken voor secties van complexe weefselstructuren¹⁶. De andere methode was om 3D-beelden te verkrijgen uit seriële secties en post-image reconstructies uit te voeren. Deze stappen waren onnauwkeurig vanwege beeldvervorming van variaties in elke seriële sectie als gevolg van gecomprimeerde of uitgerekte secties, wat resulteerde in ontbrekende informatie^16,17,18. De methode was ook bewerkelijk en tijdrovend.

Om de beeldvorming van LRC’s met volledige montage te vergemakkelijken, moeten monsters duidelijk worden gemaakt terwijl de fluorescentie goed wordt onderhouden. De huidige weefselopruimingstechnieken kunnen worden ingedeeld in drie hoofdcategorieën: organische op oplosmiddelen gebaseerde weefselopruimingstechnieken, op water gebaseerde weefselopruimingstechnieken en op hydrogel gebaseerde weefselopruimingstechnieken^17,19. Het polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerde oplosmiddelsysteem (PEGASOS) is onlangs ontwikkeld. Deze aanpak maakt bijna alle soorten weefsels transparant en behoudt endogene fluorescentie, inclusief harde weefsels zoals bot en tanden²⁰. De PEGASOS-methode heeft voordelen ten opzichte van andere weefselverwijderingsmethoden, vooral bij het opruimen van tand- en botmaterialen. De meeste andere methoden kunnen harde weefsels slechts gedeeltelijk verwijderen, hebben lange verwerkingstijden of vereisen dure reagentia²¹. Ook kan de PEGASOS-methode endogene fluorescentie efficiënt behouden ten opzichte van andere methoden.

Deze literatuur bracht ons ertoe een nieuwe methode voor celstudie te creëren. We combineerden de LRC-detectievoordelen van EdU-etikettering met de meest superieure 3D-beeldvorming van weefselgeklaarde monsters; monsters werden verwerkt met geavanceerde polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerde oplosmiddelsysteem (PEGASOS) weefselzuiveringstechniek¹⁵. Harde weefseltransparantie stelde ons in staat om het 3D-signaal van LRC’s fluorescentie in vivo te reconstrueren zonder de tanden of onderkaak te breken, waardoor een nauwkeurigere manier ontstond om LRC’s te visualiseren en te kwantificeren.

In deze studie bieden we een innovatieve gids om LRC’s in de muizensnijtand te visualiseren. We hebben een visuele 3D-benadering gemaakt om de locatie en hoeveelheid LRC’s in de stamcelniche van de muissnijtand te bepalen. Dit project maakte gebruik van EdU-etikettering, PEGASOS-weefselopruimingstechnieken en confocale microscopie. Onze methode van EdU labelen van de LRC’s op whole-mount weefsel en het gebruik van een gewist en transparant monster overwint zowel de beperkingen van traditionele doorgesneden dia’s als andere nadelige DNA-etiketteringsmethoden. Onze techniek zal dus geschikt zijn voor studies naar stamcelhomeostase die LRC-detectie vereisen, vooral op harde weefsels. Het protocol kan even voordelig zijn voor degenen die zich richten op stamcelhomeostase in andere weefsels en organen.