MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Enzimatik Bozunmadan Kaynaklanan RNA Fragmanlarının Tanımlanması
Summary
MALDI-TOF, oksitlenmiş RNA ve eksoribonükleaz Xrn-1 arasındaki reaktiviteden elde edilen fragmanları karakterize etmek için kullanıldı. Mevcut protokol, RNA ve / veya DNA içeren diğer işlemlere uygulanabilecek bir metodolojiyi açıklamaktadır.
Abstract
RNA, yaşamın tüm alanlarında bulunan bir biyopolimerdir ve DNA, proteinler, iyonlar, ilaçlar ve serbest radikaller gibi diğer moleküller ve / veya reaktif türlerle etkileşimleri her yerde bulunur. Sonuç olarak, RNA, bölünmesini, bozulmasını veya modifikasyonunu içeren çeşitli reaksiyonlara uğrar ve bu da farklı işlevlere ve etkilere sahip biyolojik olarak ilgili türlere yol açar. Bir örnek, guaninin reaktif oksijen türlerinin (ROS) varlığında ortaya çıkabilecek 7,8-dihidro-8-oksoguanine (8-oksoG) oksidasyonudur. Genel olarak, bu tür ürünleri ve dönüşümleri karakterize eden prosedürler bilimsel topluluk için büyük ölçüde değerlidir. Bu amaçla, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometresi yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Mevcut protokol, enzimatik tedaviden sonra oluşan RNA fragmanlarının nasıl karakterize edileceğini açıklamaktadır. Seçilen model, RNA ile okside bölgelerde enzimatik sindirimin durdurulduğu eksoribonükleaz Xrn-1 arasında bir reaksiyon kullanır. İki adet 20-nükleotid uzunluğunda RNA dizisi [5′-CAU GAA ACA A (8-oxoG)G CUA AAA GU] ve [5′-CAU GAA ACA A (8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] katı faz sentezi yoluyla elde edildi, UV-vis spektroskopisi ile ölçüldü ve MALDI-TOF ile karakterize edildi. Elde edilen iplikçikler daha sonra (1) 5′-fosforile edildi ve MALDI-TOF ile karakterize edildi; (2) Xrn-1 ile tedavi edilir; (3) filtrelenmiş ve tuzdan arındırılmış; (4) MALDI-TOF ile analiz edilmiştir. Bu deneysel düzenek, Xrn-1’in durmasıyla ilişkili parçaların kesin olarak tanımlanmasına yol açtı: [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ve [5′-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Tarif edilen deneyler 200 pikomol RNA (MALDI analizleri için kullanılan 20 pmol) ile gerçekleştirildi; Bununla birlikte, daha düşük miktarlar, bu çalışmada kullanılandan daha fazla güce sahip lazer kaynakları kullanan spektrometrelerle tespit edilebilir zirvelere neden olabilir. Önemli olarak, tarif edilen metodoloji genelleştirilebilir ve potansiyel olarak RNA ve DNA’yı içeren diğer süreçler için ürün tanımlamaya genişletilebilir ve diğer biyokimyasal yolların karakterizasyonuna / aydınlatılmasına yardımcı olabilir.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3, farklı boyut ve özelliklerdeki moleküllerin karakterizasyonu ve / veya tespiti için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Kullanımlarından bazıları, doğal kaynaklardan tanenlerin tespit edilmesi4, gıda5’teki metabolitlerin görüntülenmesi, hücresel ilaç hedeflerinin veya belirteçlerinin keşfi veya izlenmesi6 ve klinik teşhis7 gibi çeşitli uygulamaları içerir. Bu çalışmayla ilgili olarak, MALDI-TOF’un DNA veya RNA ile birlikte kullanılması, oligonükleotidler üzerindeki kullanımı otuz yıldan fazla bir süredirdevam etmektedir 8, burada çeşitli sınırlamalar belirtilmiştir. Bu teknik şimdi hem biyopolimerleri9 karakterize etmek hem de kimyasal ve biyokimyasal reaksiyonları tanımlamak / anlamak için güvenilir, yaygın olarak kullanılan bir araca dönüşmüştür, örneğin, RNA 10’daki platinlenmiş bölgelerin karakterizasyonu, iplik bölünmesi 11,12’yi takiben RNA fragmanlarının tanımlanması veya protein-DNA çapraz bağlantılarının oluşumu 13 . Bu nedenle, bu tekniği kullanmanın önemli yönlerini göstermek ve vurgulamak değerlidir. MALDI-TOF’un temelleri video formatında da açıklanmıştır14 ve burada daha fazla ayrıntılandırılmayacaktır. Ayrıca, DNA veya protein bağlamında uygulanması daha önce tarif edilmiş ve söz konusu formatta 15,16,17 olarak gösterilmiştir.
Enzimatik hidroliz sonrası oluşan RNA fragmanlarının tespiti için protokol burada bildirilmiştir. Deneysel model, eksoribonükleaz Xrn-1 ile oksidatif lezyon 8-oksoG içeren RNA’nın oligonükleotidleri arasındaki benzersiz reaktiviteyi belirlemek için MALDI-TOF kullanıldığı grup 18 tarafından yayınlanan yeni bir bulguya dayanarak seçildi. 20-nükleotid uzun iplikçikler katı faz sentezi19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ve [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ile elde edilirken, Xrn-1 daha önce açıklanan rapor20’yi takiben eksprese edildi ve saflaştırıldı. Kısacası, Xrn-121, oksitlenmiş RNA22 de dahil olmak üzere birden fazla RNA tipini bozan çeşitli anahtar biyolojik rollere sahip bir 5′-3′ eksoribonükleazdır. Enzimin işlenebilirliğinin, 5′-fosforile uçlar [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ve [5‘-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18 içeren RNA fragmanlarına yol açan 8-oksoG ile karşılaşıldığında durduğu bulunmuştur.
Son olarak, kütle spektrometresinin, çeşitli metodolojiler aracılığıyla, diğer amaçlara uyarlanabilecek güçlü bir yöntem olduğunu belirtmek önemlidir23,24; Bu nedenle, doğru iyonizasyon yönteminin yanı sıra diğer deney düzeneğinin seçilmesi de son derece önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iş akışındaki ana zorluk, deneylerin sonuçlandırılması ve kütle spektrometrik analizlerinin yapılması arasında ortaya çıktı. Deneyler Colorado Denver Üniversitesi’nde gerçekleştirildi ve tamamlandı ve Colorado Eyalet Üniversitesi tesislerine (bir gecede) gönderildi. Veri toplama, kolaylık sağlamak amacıyla alındıktan sonra gerçekleştirilmiştir. Birkaç beklenmedik durum süreçte zaman gecikmelerine neden oldu. Bir durumda, beklenmeyen cihaz arızaları, numunelerin tespit edilmeden ve eld…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın üç kurum, iki araştırma grubu ve bir çekirdek tesis arasında işbirliğine dayalı bir çaba olduğunu belirtmek önemlidir. Dağılım ve iş yükü şu şekilde gerçekleştirildi: Protein (Xrn-1) ekspresyonu Denver Üniversitesi’nde (Denver, CO) gerçekleştirildi. Oligonükleotid sentezi, nicelleştirme ve deney (esas olarak enzimatik bozunma) Colorado Denver Üniversitesi’nde (Denver, CO) gerçekleştirildi. Optimizasyon da orada gerçekleştirildi. MALDI-TOF tespiti, satın alma ve analizi, Colorado Eyalet Üniversitesi’ndeki Analitik Kaynaklar Çekirdek Tesisi’nde gerçekleştirildi. (Fort Collins, CO). SS, destek için bir UROP Ödülü (CU Denver) ve Eureca hibelerini (CU Denver) kabul etmek istiyor. E. G.C., R00GM115757 aracılığıyla NIGMS’nin desteğini kabul eder. MJER, 1R15GM132816 aracılığıyla NIGMS’nin desteğini kabul eder. K.B. kaynak kimliğini kabul eder: SCR_021758. Çalışma ayrıca Henry Dreyfus Vakfı’ndan TH-21-028 Öğretmen-Bilim İnsanı Ödülü (MJER) tarafından da desteklendi.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2′-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5′-mononucleotides by a 5′ leads to 3′ mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
