Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Summary
MALDI-TOF wurde verwendet, um Fragmente zu charakterisieren, die aus der Reaktivität zwischen oxidierter RNA und der Exoribonuklease Xrn-1 erhalten wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methodik, die auf andere Prozesse mit RNA und/oder DNA angewendet werden kann.
Abstract
RNA ist ein Biopolymer, das in allen Bereichen des Lebens vorkommt, und seine Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und/oder reaktiven Spezies, z. B. DNA, Proteinen, Ionen, Medikamenten und freien Radikalen, sind allgegenwärtig. Infolgedessen durchläuft RNA verschiedene Reaktionen, einschließlich ihrer Spaltung, ihres Abbaus oder ihrer Modifikation, was zu biologisch relevanten Spezies mit unterschiedlichen Funktionen und Implikationen führt. Ein Beispiel ist die Oxidation von Guanin zu 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), die in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auftreten kann. Insgesamt sind Verfahren, die solche Produkte und Transformationen charakterisieren, für die wissenschaftliche Gemeinschaft weitgehend wertvoll. Zu diesem Zweck ist die matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) eine weit verbreitete Methode. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie RNA-Fragmente, die nach enzymatischer Behandlung gebildet werden, charakterisiert werden können. Das gewählte Modell verwendet eine Reaktion zwischen RNA und der Exoribonuklease Xrn-1, bei der die enzymatische Verdauung an oxidierten Stellen gestoppt wird. Zwei 20-Nukleotid lange RNA-Sequenzen [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] wurden durch Festphasensynthese erhalten, quantifiziert durch UV-Vis-Spektroskopie und charakterisiert durch MALDI-TOF. Die erhaltenen Stränge wurden dann (1) 5′-phosphoryliert und mittels MALDI-TOF charakterisiert; (2) mit Xrn-1 behandelt; (3) gefiltert und entsalzt; (4) analysiert über MALDI-TOF. Dieser Versuchsaufbau führte zur eindeutigen Identifizierung der Fragmente, die mit dem Abwürgen von Xrn-1 verbunden sind: [5′-H2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5′-H2 PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Die beschriebenen Experimente wurden mit 200 Picomolen RNA (20 pmol für MALDI-Analysen) durchgeführt; Geringere Mengen können jedoch zu nachweisbaren Spitzen mit Spektrometern führen, die Laserquellen mit mehr Leistung als die in dieser Arbeit verwendete verwenden. Wichtig ist, dass die beschriebene Methodik verallgemeinert und möglicherweise auf die Produktidentifizierung für andere Prozesse mit RNA und DNA ausgedehnt werden kann und bei der Charakterisierung / Aufklärung anderer biochemischer Signalwege helfen kann.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 ist eine weit verbreitete Technik zur Charakterisierung und/oder Detektion von Molekülen unterschiedlicher Größe und Eigenschaften. Einige seiner Anwendungen umfassen verschiedene Anwendungen wie den Nachweis von Tanninen aus natürlichen Ressourcen4, die Bildgebung von Metaboliten in Lebensmitteln5, die Entdeckung oder Überwachung von zellulären Wirkstoffzielen oder Markern6 und die klinische Diagnostik7, um nur einige zu nennen. Von Relevanz für die vorliegende Arbeit ist die Verwendung von MALDI-TOF mit DNA oder RNA, wobei seine Verwendung auf Oligonukleotiden auf über drei Jahrzehnte zurückgeht8, wo mehrere Einschränkungen festgestellt wurden. Diese Technik hat sich nun zu einem zuverlässigen, häufig verwendeten Mittel entwickelt, um sowohlBiopolymere 9 zu charakterisieren als auch chemische und biochemische Reaktionen zu identifizieren/verstehen, z. B. die Charakterisierung platinierter Stellen in RNA10, die Identifizierung von RNA-Fragmenten nach der Strangspaltung 11,12 oder die Bildung von Protein-DNA-Querverbindungen 13 . Daher ist es wertvoll, wichtige Aspekte der Verwendung dieser Technik zu veranschaulichen und hervorzuheben. Die Grundlagen von MALDI-TOF wurden auch im Videoformat14 beschrieben und werden hier nicht weiter ausgeführt. Darüber hinaus wurde seine Anwendung in einem DNA- oder Proteinkontext zuvor in dem genannten Format15,16,17 beschrieben und veranschaulicht.
Das Protokoll zum Nachweis von RNA-Fragmenten, die nach enzymatischer Hydrolyse gebildet werden, wird hierin berichtet. Das experimentelle Modell wurde auf der Grundlage eines kürzlich von unserer Gruppe18 veröffentlichten Ergebnisses ausgewählt, bei dem MALDI-TOF verwendet wurde, um die einzigartige Reaktivität zwischen der Exoribonuklease Xrn-1 und Oligonukleotiden von RNA zu bestimmen, die die oxidative Läsion 8-OxoG enthalten. Die 20-Nukleotid-Langstränge wurden durch Festphasensynthese19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] erhalten, während Xrn-1 nach dem zuvor beschriebenen Bericht20 exprimiert und gereinigt wurde. Kurz gesagt, Xrn-121 ist eine 5′-3′-Exoribonuklease mit verschiedenen biologischen Schlüsselrollen, die mehrere Arten von RNA, einschließlich oxidierter RNA22, abbauen. Es wurde festgestellt, dass die Prozessivität des Enzyms bei der Begegnung mit 8-OxoG zum Stillstand kommt, was zu RNA-Fragmenten führte, die 5′-phosphorylierte Enden [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18 enthielten.
Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Massenspektrometrie eine leistungsfähige Methode ist, die durch verschiedene Methoden an andere Zwecke angepasst werden kann23,24; Daher ist die Wahl der richtigen Ionisationsmethode sowie anderer Versuchsaufbauten von größter Bedeutung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die größte Herausforderung in diesem Arbeitsablauf bestand zwischen dem Abschluss der Experimente und der Durchführung der massenspektrometrischen Analysen. Die Experimente wurden an der University of Colorado Denver durchgeführt und abgeschlossen und (über Nacht) an die Einrichtungen der Colorado State University verschifft. Die Datenerfassung erfolgte nach Erhalt nach Bequemlichkeit. Mehrere unerwartete Umstände führten zu Zeitverzögerungen im Prozess. In einem Fall erforderten unerwartete Fehlfunktionen des In…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Es ist wichtig zu beachten, dass diese Arbeit eine gemeinsame Anstrengung zwischen drei Institutionen, zwei Forschungsgruppen und einer Kerneinrichtung war. Die Verteilung und der Arbeitsaufwand wurden wie folgt durchgeführt: Die Proteinexpression (Xrn-1) wurde an der Universität von Denver (Denver, CO) durchgeführt. Oligonukleotidsynthese, Quantifizierung und Experimente (hauptsächlich enzymatischer Abbau) wurden an der University of Colorado Denver (Denver, CO) durchgeführt. Dort wurde auch eine Optimierung durchgeführt. MALDI-TOF-Spotting, Akquisition und Analyse wurden in der Analytical Resources Core Facility der Colorado State University durchgeführt. (Fort Collins, CO). SS möchte einen UROP Award (CU Denver) und Eureca Grants (CU Denver) für die Unterstützung anerkennen. E. G.C. bestätigt die Unterstützung von NIGMS über R00GM115757. MJER dankt der Unterstützung von NIGMS über 1R15GM132816. K.B. bestätigt die Ressourcen-ID: SCR_021758. Die Arbeit wurde auch durch einen Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, der Henry Dreyfus Foundation unterstützt.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
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