Идентификация фрагментов РНК в результате ферментативной деградации с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF
Summary
MALDI-TOF был использован для характеристики фрагментов, полученных из реактивности между окисленной РНК и экзорибонуклеазой Xrn-1. Настоящий протокол описывает методологию, которая может быть применена к другим процессам, включающим РНК и/или ДНК.
Abstract
РНК является биополимером, присутствующим во всех областях жизни, и его взаимодействия с другими молекулами и / или реактивными видами, например, ДНК, белками, ионами, лекарствами и свободными радикалами, распространены повсеместно. В результате РНК подвергается различным реакциям, которые включают ее расщепление, деградацию или модификацию, что приводит к биологически значимым видам с различными функциями и последствиями. Одним из примеров является окисление гуанина до 7,8-дигидро-8-оксогуанина (8-оксоG), которое может происходить в присутствии активных форм кислорода (АФК). В целом, процедуры, которые характеризуют такие продукты и преобразования, в значительной степени ценны для научного сообщества. С этой целью масс-спектрометрия времени пролета с матричной лазерной десорбцией ионизации (MALDI-TOF) является широко используемым методом. Настоящий протокол описывает, как охарактеризовать фрагменты РНК, образующиеся после ферментативной обработки. В выбранной модели используется реакция между РНК и экзорибонуклеазой Xrn-1, где ферментативное сбраживание останавливается на окисленных участках. Две 20-нуклеотидные длинные последовательности РНК [5′-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] и [5′-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] были получены путем твердофазного синтеза, количественно оценены С помощью спектроскопии UV-vis и охарактеризованы с помощью MALDI-TOF. Полученные нити затем (1) 5′-фосфорилировали и характеризовали с помощью MALDI-TOF; (2) обработанные Xrn-1; (3) отфильтрованные и обессоленные; (4) проанализировано с помощью MALDI-TOF. Эта экспериментальная установка привела к однозначной идентификации фрагментов, связанных с остановкой Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] и [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Описанные эксперименты проводились с 200 пикомолью РНК (20 пмоль, используемых для анализа MALDI); однако более низкие количества могут привести к обнаруживаемым пикам с помощью спектрометров, использующих лазерные источники с большей мощностью, чем тот, который используется в этой работе. Важно отметить, что описанная методология может быть обобщена и потенциально расширена до идентификации продукта для других процессов, включающих РНК и ДНК, и может помочь в характеристике/выяснении других биохимических путей.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 является широко используемым методом для характеристики и/или обнаружения молекул различных размеров и характеристик. Некоторые из его применений включают различные приложения, такие как обнаружение танинов из природных ресурсов4, визуализация метаболитов в пище5, обнаружение или мониторинг клеточных лекарственных мишеней или маркеров6 и клиническая диагностика7, чтобы назвать несколько. Для настоящей работы имеет отношение использование MALDI-TOF с ДНК или РНК, с его использованием на олигонуклеотидах, датируемых более чем тремя десятилетиями8, где было отмечено несколько ограничений. Этот метод в настоящее время превратился в надежное, широко используемое средство для характеристики как биополимеров9, так и идентификации/понимания химических и биохимических реакций, например, характеристики платинированных участков в РНК10, идентификации фрагментов РНК после расщепления нитей 11,12 или образования поперечных связей белок-ДНК 13 . Таким образом, полезно проиллюстрировать и выделить важные аспекты использования этой техники. Основы MALDI-TOF были описаны в видеоформате, а также14 и не будут более подробно рассмотрены в настоящем документе. Кроме того, его применение в контексте ДНК или белка было ранее описано и проиллюстрировано в указанном формате 15,16,17.
Протокол обнаружения фрагментов РНК, образующихся после ферментативного гидролиза, приведен в настоящем документе. Экспериментальная модель была выбрана на основе недавнего открытия, опубликованного нашей группой18, где MALDI-TOF был использован для определения уникальной реакционной способности между экзорибонуклеазой Xrn-1 и олигонуклеотидами РНК, содержащими окислительное поражение 8-oxoG. 20-нуклеотидные длинные нити получали путем твердофазного синтеза19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] и [5′-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], в то время как Xrn-1 экспрессировали и очищали в соответствии с ранее описанным отчетом20. Короче говоря, Xrn-121 представляет собой экзорибонуклеазу 5′-3′ с различными ключевыми биологическими ролями, которые разлагают несколько типов РНК, включая окисленную РНК22. Было установлено, что процессичность фермента останавливается при столкновении с 8-оксоG, что приводило к фрагментам РНК, содержащим 5′-фосфорилированные концы [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] и [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Наконец, важно отметить, что масс-спектрометрия является мощным методом, который с помощью различных методологий может быть адаптирован к другим целям23,24; таким образом, выбор правильного метода ионизации, а также других экспериментальных установок имеет первостепенное значение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основная проблема в этом рабочем процессе возникла между завершением экспериментов и проведением масс-спектрометрического анализа. Эксперименты были проведены и завершены в Университете Колорадо в Денвере и отправлены (ночью) на объекты Университета штата Колорадо. Сбор данных осущ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Важно отметить, что эта работа была результатом совместных усилий трех учреждений, двух исследовательских групп и одного основного объекта. Распределение и рабочая нагрузка осуществлялись следующим образом: экспрессия белка (Xrn-1) проводилась в Университете Денвера (Денвер, Штат Колорадо). Синтез, количественная оценка и эксперименты олигонуклеотидов (в основном ферментативная деградация) проводились в Университете Колорадо в Денвере (Денвер, штат Колорадо). Там же проводилась оптимизация. Обнаружение, приобретение и анализ MALDI-TOF проводились в Центре аналитических ресурсов Университета штата Колорадо. (Форт-Коллинз, Колорадо). SS хотела бы отметить гранты UROP Award (CU Denver) и Eureca (CU Denver) за поддержку. E. G.C. подтверждает поддержку со стороны NIGMS через R00GM115757. MJER подтверждает поддержку от NIGMS, через 1R15GM132816. K.B. подтверждает идентификатор ресурса: SCR_021758. Работа также была поддержана премией Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, от Фонда Генри Дрейфуса.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2′-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5′-mononucleotides by a 5′ leads to 3′ mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
