تحديد شظايا الحمض النووي الريبي الناتجة عن التحلل الأنزيمي باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF
Summary
تم استخدام MALDI-TOF لتوصيف الشظايا التي تم الحصول عليها من التفاعل بين الحمض النووي الريبي المؤكسد و exoribonuclease Xrn-1. يصف هذا البروتوكول منهجية يمكن تطبيقها على العمليات الأخرى التي تنطوي على الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي.
Abstract
الحمض النووي الريبي هو بوليمر حيوي موجود في جميع مجالات الحياة ، وتفاعلاته مع الجزيئات الأخرى و / أو الأنواع التفاعلية ، على سبيل المثال ، الحمض النووي والبروتينات والأيونات والأدوية والجذور الحرة ، موجودة في كل مكان. ونتيجة لذلك، يخضع الحمض النووي الريبي لتفاعلات مختلفة تشمل انقسامه أو تدهوره أو تعديله، مما يؤدي إلى أنواع ذات صلة بيولوجيا ذات وظائف وآثار متميزة. أحد الأمثلة على ذلك هو أكسدة الغوانين إلى 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) ، والتي قد تحدث في وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). وعموما، فإن الإجراءات التي تميز هذه المنتجات والتحولات ذات قيمة كبيرة للمجتمع العلمي. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن قياس الطيف الكتلي للازتناص بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF) هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع. يصف البروتوكول الحالي كيفية توصيف شظايا الحمض النووي الريبي التي تشكلت بعد العلاج الإنزيمي. يستخدم النموذج المختار تفاعلا بين الحمض النووي الريبي و exoribonuclease Xrn-1 ، حيث يتم إيقاف الهضم الأنزيمي في المواقع المؤكسدة. تم الحصول على تسلسلين من الحمض النووي الريبي الطويل المكون من 20 نيوكليوتيد [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] و [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG) (8-oxoG) cua AAA GU] عن طريق توليف الطور الصلب ، الذي تم تحديده كميا بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية ، وتم تمييزه عبر MALDI-TOF. ثم كانت الخيوط التي تم الحصول عليها (1) 5′-فسفوريلات وتتميز عبر MALDI-TOF. (2) تعامل مع Xrn-1 ؛ (3) تصفيتها ومملحة ؛ (4) تم تحليلها عبر MALDI-TOF. أدى هذا الإعداد التجريبي إلى تحديد لا لبس فيه للشظايا المرتبطة بتوقف Xrn-1: [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU] ، [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG) (8-oxoG) CUA AAA GU] ، و [5′-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. وأجريت التجارب الموصوفة باستخدام 200 بيكومول من الحمض النووي الريبي (20 بيمول يستخدم في تحليلات MALDI)؛ ومع ذلك ، قد تؤدي الكميات المنخفضة إلى قمم يمكن اكتشافها باستخدام مطياف باستخدام مصادر ليزر ذات طاقة أكبر من تلك المستخدمة في هذا العمل. والأهم من ذلك، أن المنهجية الموصوفة يمكن تعميمها وربما توسيعها لتشمل تحديد المنتجات لعمليات أخرى تنطوي على الحمض النووي الريبي والحمض النووي، وقد تساعد في توصيف/توضيح المسارات البيوكيميائية الأخرى.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لتوصيف و / أو الكشف عن الجزيئات ذات الأحجام والخصائص المختلفة. وتشمل بعض استخداماته تطبيقات متنوعة مثل الكشف عن العفص من الموارد الطبيعية4 ، وتصوير المستقلبات في الغذاء5 ، واكتشاف أو مراقبة أهداف أو علامات الأدوية الخلوية6 ، والتشخيص السريري7 ، على سبيل المثال لا الحصر. ومما له صلة بهذا العمل استخدام MALDI-TOF مع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، مع استخدامه على أوليغونوكليوتيدات يعود تاريخها إلى أكثر من ثلاثة عقود8، حيث لوحظت عدة قيود. تطورت هذه التقنية الآن إلى وسيلة موثوقة وشائعة الاستخدام لتوصيف كل من البوليمرات الحيوية9 وتحديد / فهم التفاعلات الكيميائية والكيميائية الحيوية ، على سبيل المثال ، توصيف المواقع المطلية في الحمض النووي الريبي 10 ، وتحديد شظايا الحمض النووي الريبي بعد انقسام الخيط11,12 ، أو تشكيل روابط متقاطعة بين البروتين والحمض النووي13 . وبالتالي ، من المفيد توضيح وتسليط الضوء على الجوانب المهمة لاستخدام هذه التقنية. تم وصف أساسيات MALDI-TOF في شكل فيديو بالإضافة إلى14 ولن يتم تفصيلها بشكل أكبر هنا. علاوة على ذلك ، تم وصف تطبيقه في سياق الحمض النووي أو البروتين سابقا وتوضيحه في الشكل المذكور15،16،17.
بروتوكول الكشف عن شظايا الحمض النووي الريبي التي تشكلت بعد التحلل المائي الأنزيمي هو المبلغ عنه هنا. تم اختيار النموذج التجريبي بناء على اكتشاف حديث نشرته مجموعتنا18 ، حيث تم استخدام MALDI-TOF لتحديد التفاعل الفريد بين exoribonuclease Xrn-1 و oligonucleotides من الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الآفة التأكسدية 8-oxoG. تم الحصول على خيوط طويلة من 20 نيوكليوتيد عن طريق تخليق الطور الصلب19 ، [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] و [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG) (8-oxoG) cua AAA GU] ، في حين تم التعبير عن Xrn-1 وتنقيته بعد التقرير20 الموصوف سابقا. باختصار ، Xrn-121 هو إكسريبونوكلياز 5 ‘-3’ مع العديد من الأدوار البيولوجية الرئيسية التي تحلل أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي المؤكسد22. وجد أن عملية الإنزيم تتوقف عند مواجهة 8-oxoG ، مما أدى إلى شظايا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نهايات 5′-phosphorylated [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU] ، [5′-H 2 PO 4-(8-oxoG) (8-oxoG) cua aaa gu] ، و [5′-H2PO 4-(8-oxoG) cua aaa gu]18.
وأخيرا، من المهم ملاحظة أن قياس الطيف الكتلي هو طريقة قوية يمكن، من خلال منهجيات مختلفة، تكييفها مع أغراض أخرى23،24؛ وبالتالي ، فإن اختيار طريقة التأين الصحيحة بالإضافة إلى الإعداد التجريبي الآخر له أهمية قصوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
نشأ التحدي الرئيسي في سير العمل هذا بين الانتهاء من التجارب وإجراء التحليلات الطيفية الكتلية. أجريت التجارب وأكملت في جامعة كولورادو دنفر وشحنت (بين عشية وضحاها) إلى مرافق جامعة ولاية كولورادو. تم الحصول على البيانات عند استلامها ، حسب الراحة. أدت عدة ظروف غير متوقعة إلى تأخيرات زمنية في ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المهم ملاحظة أن هذا العمل كان جهدا تعاونيا بين ثلاث مؤسسات، ومجموعتين بحثيتين، ومرفق أساسي واحد. تم تنفيذ التوزيع وعبء العمل على النحو التالي: تم تنفيذ تعبير البروتين (Xrn-1) في جامعة دنفر (دنفر ، كولورادو). تم إجراء توليف أوليغونوكليوتيدات ، وتحديد كمي ، وتجريب (التحلل الأنزيمي بشكل رئيسي) في جامعة كولورادو دنفر (دنفر ، كولورادو). كما تم تنفيذ التحسين هناك. تم إجراء اكتشاف MALDI-TOF واقتنائه وتحليله في المرفق الأساسي للموارد التحليلية في جامعة ولاية كولورادو. (فورت كولينز ، كولورادو). تود SS أن تعترف بجائزة UROP (CU Denver) ومنح Eureca (CU Denver) للدعم. يقر E. G.C. بالدعم المقدم من NIGMS ، عبر R00GM115757. تقر MJER بالدعم المقدم من NIGMS ، عبر 1R15GM132816. K.B. يقر بمعرف المورد: SCR_021758. تم دعم العمل أيضا من قبل جائزة المعلم والباحث (MJER) ، TH-21-028 ، من مؤسسة هنري دريفوس.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2′-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5′-mononucleotides by a 5′ leads to 3′ mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
