זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF
Summary
MALDI-TOF שימש לאפיון שברים שהתקבלו מהתגובתיות בין RNA מחומצן לבין exoribonuclease Xrn-1. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה שניתן ליישם על תהליכים אחרים המערבים רנ”א ו/או דנ”א.
Abstract
רנ”א הוא ביופולימר הנמצא בכל תחומי החיים, והאינטראקציות שלו עם מולקולות אחרות ו/או מינים תגובתיים אחרים, למשל דנ”א, חלבונים, יונים, תרופות ורדיקלים חופשיים, נמצאות בכל מקום. כתוצאה מכך, הרנ”א עובר תגובות שונות הכוללות את הבקיעה, ההתפרקות או השינוי שלו, מה שמוביל למינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם פונקציות והשלכות שונות. דוגמה אחת היא חמצון של גואנין ל-7,8-דיהידרו-8-אוקסוגואנין (8-oxoG), שעשוי להתרחש בנוכחות מיני חמצן תגובתי (ROS). באופן כללי, נהלים המאפיינים מוצרים ותמורות כאלה הם בעלי ערך רב לקהילה המדעית. לשם כך, ספקטרומטריית מסה של יינון יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-TOF) היא שיטה נפוצה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לאפיין שברי RNA שנוצרו לאחר טיפול אנזימטי. המודל שנבחר משתמש בתגובה בין RNA לבין exoribonuclease Xrn-1, שבו העיכול האנזימטי נעצר באתרים מחומצנים. שני רצפי RNA באורך 20 נוקלאוטידים [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ו-[5′-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] התקבלו באמצעות סינתזה של פאזה מוצקה, כומתו על ידי ספקטרוסקופיית UV-vis, ואופיינו באמצעות MALDI-TOF. הגדילים שהתקבלו היו אז (1) 5′-זרחן ואופיינו באמצעות MALDI-TOF; (2) מטופל ב-Xrn-1; (3) מסונן ומתופל; (4) נותח באמצעות MALDI-TOF. מערך ניסוי זה הוביל לזיהוי חד משמעי של השברים הקשורים לעיכוב של Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], ו-[5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. הניסויים המתוארים בוצעו עם 200 פיקומולים של RNA (20 pmol המשמשים לניתוחי MALDI); עם זאת, כמויות נמוכות יותר עשויות לגרום לשיאים הניתנים לזיהוי עם ספקטרומטרים המשתמשים במקורות לייזר עם יותר כוח מזה המשמש בעבודה זו. חשוב לציין כי ניתן להכליל את המתודולוגיה המתוארת ולהרחיב אותה באופן פוטנציאלי לזיהוי מוצרים עבור תהליכים אחרים המערבים רנ”א ודנ”א, ועשויה לסייע באפיון/הבהרה של מסלולים ביוכימיים אחרים.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 היא טכניקה נפוצה לאפיון ו/או זיהוי של מולקולות בגדלים ומאפיינים שונים. חלק מהשימושים בו כוללים יישומים מגוונים כגון איתור טאנינים ממשאבי טבע4, מטבוליטים של הדמיה במזון5, גילוי או ניטור של מטרות או סמנים של תרופות תאיות6, ואבחון קליני7, אם להזכיר כמה. הרלוונטיות לעבודה הנוכחית היא השימוש ב-MALDI-TOF עם DNA או RNA, כאשר השימוש בו על אוליגונוקלאוטידים מתוארך ליותר משלושה עשורים8, שם צוינו מספר מגבלות. טכניקה זו התפתחה כעת לאמצעי אמין ונפוץ לאפיון שני הביופולימרים9 ולזיהוי/הבנה של תגובות כימיות וביוכימיות, למשל, אפיון של אתרים מוקפים ברנ”א10, זיהוי שברי RNA בעקבות ביקוע גדיל 11,12, או יצירת קשרים צולבים בין חלבון לדנ”א13 . לפיכך, חשוב להמחיש ולהדגיש היבטים חשובים של שימוש בטכניקה זו. היסודות של MALDI-TOF תוארו בפורמט וידאו גםכן 14 ולא יפורטו עוד יותר כאן. יתר על כן, היישום שלו בהקשר של דנ”א או חלבון תואר בעבר והודגם בפורמט האמור 15,16,17.
הפרוטוקול לאיתור מקטעי RNA שנוצרו לאחר הידרוליזה אנזימטית מדווח כאן. המודל הניסיוני נבחר על סמך ממצא שפורסם לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו18, שבו MALDI-TOF שימש כדי לקבוע את התגובתיות הייחודית בין exoribonuclease Xrn-1 לבין oligonucleotides של RNA המכיל את הנגע החמצוני 8-oxoG. גדילי 20 הנוקלאוטידים הארוכים התקבלו באמצעות סינתזה של פאזה מוצקה19, [5′-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ו-[5′-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], בעוד ש-Xrn-1 הובטא וטוהר בעקבות דו”ח20 שתואר קודם לכן. בקצרה, Xrn-121 הוא אקסוריבונוקלאז 5′-3′ עם תפקידים ביולוגיים מרכזיים שונים המפרקים סוגים רבים של RNA, כולל RNA22 מחומצן. נמצא כי התהליכיות של האנזים מתעכבת כאשר נתקלים ב-8-oxoG, מה שהוביל למקטעי RNA המכילים 5′-קצוות זרחניים [5′-H 2 PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], ו-[5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
לבסוף, חשוב לציין כי ספקטרומטריית מסות היא שיטה רבת עוצמה, שבאמצעות מתודולוגיות שונות, ניתן להתאים אותה למטרות אחרות23,24; לפיכך, בחירת שיטת היינון הנכונה, כמו גם מערך ניסיוני אחר, היא בעלת חשיבות עליונה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האתגר העיקרי בתהליך עבודה זה התעורר בין השלמת הניסויים לבין ביצוע הניתוחים הספקטרומטריים של המסות. הניסויים בוצעו והושלמו באוניברסיטת קולורדו דנבר ונשלחו (בן לילה) למתקני אוניברסיטת המדינה של קולורדו. איסוף הנתונים בוצע עם קבלתו, לפי הנוחות. מספר נסיבות בלתי צפויות הובילו לעיכובים בזמן ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חשוב לציין שעבודה זו הייתה מאמץ משותף בין שלושה מוסדות, שתי קבוצות מחקר ומתקן ליבה אחד. ההפצה ועומס העבודה בוצעו כדלקמן: ביטוי חלבון (Xrn-1) בוצע באוניברסיטת דנבר (דנבר, קולורדו). סינתזה, כימות וניסויים של אוליגונוקלאוטידים (בעיקר השפלה אנזימטית) נערכו באוניברסיטת קולורדו דנבר (דנבר, קולורדו). כמו כן בוצע שם אופטימיזציה. איתור, רכישה וניתוח של MALDI-TOF בוצעו במתקן הליבה של המשאבים האנליטיים באוניברסיטת המדינה של קולורדו. (פורט קולינס, קולורדו). SS רוצה להודות על פרס UROP (CU דנבר) ומענקי Eureca (CU דנבר) לתמיכה. E. G.C. מכיר בתמיכה של NIGMS, באמצעות R00GM115757. MJER מאשרת תמיכה מ- NIGMS, באמצעות 1R15GM132816. K.B. מכיר במזהה משאב: SCR_021758. העבודה נתמכה גם על ידי פרס מורה-חוקר (MJER), TH-21-028, מטעם קרן הנרי דרייפוס.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2′-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5′-mononucleotides by a 5′ leads to 3′ mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
