MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定
Summary
MALDI−TOFを用いて、酸化されたRNAとエキソリボヌクレアーゼXrn−1との間の反応性から得られた断片を特徴付けた。本プロトコルは、RNAおよび/またはDNAを含む他のプロセスに適用できる方法論を記載する。
Abstract
RNAは生命のすべてのドメインに存在する生体高分子であり、他の分子および/または反応種、例えばDNA、タンパク質、イオン、薬物、およびフリーラジカルとの相互作用は遍在している。その結果、RNAは、その切断、分解、または修飾を含む様々な反応を受け、別個の機能および含意を有する生物学的に関連する種をもたらす。1つの例は、グアニンの7,8−ジヒドロ−8−オキソグアニン(8−oxoG)への酸化であり、これは活性酸素種(ROS)の存在下で起こり得る。全体として、このような製品と変換を特徴付ける手順は、科学界にとって主に価値があります。この目的のために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI−TOF)質量分析法は広く使用されている方法である。本プロトコールは、酵素処理後に形成されたRNA断片を特徴付ける方法を記載する。選択されたモデルは、RNAとエキソリボヌクレアーゼXrn-1との間の反応を使用し、酵素消化は酸化部位で停止する。2つの20ヌクレオチド長のRNA配列[5′-CAUガアACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU]および[5′-CAUガアACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]を固相合成によって得、UV-vis分光法によって定量し、MALDI-TOFを介して特徴付けた。次いで、得られた鎖を(1)5′-リン酸化し、MALDI−TOFを介して特徴付け;(2)Xrn-1で処理する工程;(3)濾過および脱塩;(4)マルディ-TOFを介して分析する。この実験セットアップは、Xrn-1の失速に関連する断片の明確な同定につながった:[5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU]、[5′-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua aaa gu]、および[5′-H2PO4-(8-oxoG) cua aaa gu]。記載された実験を、200個のピコモールのRNA(MALDI分析に20pmol使用した)を用いて実施した。しかし、量が少ないと、この作業で使用されたものよりも強力なレーザー光源を使用する分光器で検出可能なピークが生じる可能性があります。重要なことに、記載された方法論は一般化され、RNAおよびDNAを含む他のプロセスの産物同定に拡張することができ、他の生化学的経路の特性評価/解明に役立つ可能性がある。
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3は、さまざまなサイズおよび特性の分子の特性評価および/または検出に広く使用されている技術です。その用途には、天然資源4からのタンニンの検出、食品中の代謝産物のイメージング5、細胞薬物標的またはマーカーの発見またはモニタリング6、臨床診断7など、さまざまな用途が含まれます。本研究に関連するのは、DNAまたはRNAを用いたMALDI-TOFの使用であり、オリゴヌクレオチドに対するその使用は30年以上前にさかのぼる8、そこでいくつかの制限が指摘された。この技術は、現在、生体高分子9の両方を特徴付け、化学的および生化学的反応を同定/理解するために、信頼性が高く一般的に使用される手段、例えば、RNA10中の白金化部位の特性評価、鎖切断後のRNA断片の同定11、12、またはタンパク質-DNA架橋の形成13に進化した。.したがって、この手法を使用する際の重要な側面を説明し、強調することは有益です。MALDI-TOFの基本は、ビデオフォーマットで説明されており、14と同様に、本明細書ではさらに詳しく説明しない。さらに、DNAまたはタンパク質の文脈におけるその適用は、前記フォーマット15、16、17において以前に記載および例示されている。
酵素加水分解後に形成されるRNA断片を検出するためのプロトコールが本明細書に報告される。実験モデルは、我々のグループ18によって発表された最近の知見に基づいて選択され、MALDI-TOFを用いて、酸化的病変8-oxoGを含むRNAのエキソリボヌクレアーゼXrn-1とオリゴヌクレオチドとの間のユニークな反応性を決定した。20ヌクレオチド長鎖を固相合成19、[5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU]および[5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) cua AAA GU]により得、Xrn-1は前述の報告20に従って発現および精製した。簡単に言えば、Xrn−121は、酸化RNA22を含む複数のタイプのRNAを分解する様々な重要な生物学的役割を有する5’−3’エキソリボヌクレアーゼである。8-oxoGに遭遇すると酵素のプロセス性が失速し、5′-リン酸化末端[5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU]、[5′-H2PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG)cua AAA GU]、および[5′-H2PO4-(8-oxoG)CUA AAA GU]18を含むRNA断片が生じたことが判明した。
最後に、質量分析は、様々な方法論を通じて、他の目的に適合させることができる強力な方法であることに注意することが重要です23,24。したがって、適切なイオン化方法と他の実験セットアップを選択することが最も重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このワークフローの主な課題は、実験の完了と質量分析の実行の間に生じました。実験はコロラド大学デンバー校で実施され、完了し、コロラド州立大学の施設に(一晩)出荷された。データ取得は、便宜上、受領時に実施した。いくつかの予期せぬ状況により、プロセスの時間遅れが発生しました。ある例では、予期せぬ機器の誤動作により、発見と取得の前にサンプルを凍結(21日間1回)する…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、3つの機関、2つの研究グループ、1つのコア施設間の共同作業であったことに注意することが重要です。分布および作業負荷を以下のように実施した:タンパク質(Xrn−1)発現は、デンバー大学(コロラド州デンバー)で行った。オリゴヌクレオチドの合成、定量、および実験(主に酵素分解)をコロラド大学デンバー校(コロラド州デンバー)で行った。最適化もそこで行われました。MALDI-TOFの発見、取得、分析は、コロラド州立大学の分析資源コアファシリティで実施されました。(コロラド州フォートコリンズ)。SSはUROP賞(CUデンバー)とユーレカ助成金(CUデンバー)の支援を認めたいと思います。E. G.C. は、R00GM115757 を介して NIGMS からのサポートを認めています。MJER は、1R15GM132816 を介して NIGMS からのサポートを認識しています。K.B. はリソース ID: SCR_021758 を確認します。この研究は、ヘンリー・ドレフュス財団の教師学者賞(MJER)、TH-21-028によっても支援されました。
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
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