Identificatie van RNA-fragmenten als gevolg van enzymatische degradatie met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie
Summary
MALDI-TOF werd gebruikt om fragmenten te karakteriseren die werden verkregen uit de reactiviteit tussen geoxideerd RNA en het exoribonuclease Xrn-1. Dit protocol beschrijft een methodiek die toepasbaar is op andere processen waarbij RNA en/of DNA betrokken is.
Abstract
RNA is een biopolymeer dat aanwezig is in alle domeinen van het leven en de interacties met andere moleculen en / of reactieve soorten, bijvoorbeeld DNA, eiwitten, ionen, medicijnen en vrije radicalen, zijn alomtegenwoordig. Als gevolg hiervan ondergaat RNA verschillende reacties, waaronder de splitsing, afbraak of modificatie, wat leidt tot biologisch relevante soorten met verschillende functies en implicaties. Een voorbeeld is de oxidatie van guanine tot 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), die kan optreden in aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Over het algemeen zijn procedures die dergelijke producten en transformaties kenmerken grotendeels waardevol voor de wetenschappelijke gemeenschap. Hiertoe is matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie een veel gebruikte methode. Het huidige protocol beschrijft hoe RNA-fragmenten gevormd na enzymatische behandeling kunnen worden gekarakteriseerd. Het gekozen model maakt gebruik van een reactie tussen RNA en het exoribonuclease Xrn-1, waarbij de enzymatische spijsvertering wordt gestopt op geoxideerde plaatsen. Twee 20-nucleotide lange RNA-sequenties [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] en [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] werden verkregen via vastefasesynthese, gekwantificeerd door UV-vis spectroscopie, en gekarakteriseerd via MALDI-TOF. De verkregen strengen werden vervolgens (1) 5′-gefosforyleerd en gekarakteriseerd via MALDI-TOF; (2) behandeld met Xrn-1; (3) gefilterd en ontzout; (4) geanalyseerd via MALDI-TOF. Deze experimentele opstelling leidde tot de ondubbelzinnige identificatie van de fragmenten geassocieerd met het stallen van Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], en [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beschreven experimenten werden uitgevoerd met 200 picomol RNA (20 pmol gebruikt voor MALDI-analyses); lagere hoeveelheden kunnen echter resulteren in detecteerbare pieken met spectrometers met behulp van laserbronnen met meer vermogen dan degene die in dit werk wordt gebruikt. Belangrijk is dat de beschreven methodologie kan worden gegeneraliseerd en mogelijk kan worden uitgebreid tot productidentificatie voor andere processen waarbij RNA en DNA betrokken zijn, en kan helpen bij de karakterisering / opheldering van andere biochemische routes.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 is een veelgebruikte techniek voor de karakterisering en/of detectie van moleculen van verschillende groottes en eigenschappen. Sommige van de toepassingen omvatten diverse toepassingen, zoals het detecteren van tannines uit natuurlijke hulpbronnen4, beeldvorming van metabolieten in voedsel5, ontdekking of monitoring van cellulaire medicijndoelen of markers6 en klinische diagnostiek7, om er maar een paar te noemen. Van belang voor het huidige werk is het gebruik van MALDI-TOF met DNA of RNA, waarbij het gebruik ervan op oligonucleotiden dateert uit meer dan drie decennia8, waar verschillende beperkingen werden opgemerkt. Deze techniek is nu geëvolueerd naar een betrouwbaar, veelgebruikt middel om zowel biopolymeren9 te karakteriseren als chemische en biochemische reacties te identificeren/begrijpen, bijvoorbeeld karakterisering van platinated sites in RNA10, identificatie van RNA-fragmenten na strengsplitsing 11,12, of vorming van eiwit-DNA cross-links13 . Het is dus waardevol om belangrijke aspecten van het gebruik van deze techniek te illustreren en te benadrukken. De basis van MALDI-TOF is ook in videoformaat beschreven14 en zal hierin niet verder worden uitgewerkt. Bovendien is de toepassing ervan in een DNA- of eiwitcontext eerder beschreven en geïllustreerd in het genoemde formaat 15,16,17.
Het protocol voor het detecteren van RNA-fragmenten gevormd na enzymatische hydrolyse wordt hierin gerapporteerd. Het experimentele model werd gekozen op basis van een recente bevinding gepubliceerd door onze groep18, waar MALDI-TOF werd gebruikt om de unieke reactiviteit te bepalen tussen het exoribonuclease Xrn-1 en oligonucleotiden van RNA dat de oxidatieve laesie 8-oxoG bevat. De 20-nucleotide lange strengen werden verkregen via vaste-fase synthese19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] en [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], terwijl Xrn-1 werd uitgedrukt en gezuiverd na het eerder beschreven rapport20. Kortom, Xrn-121 is een 5′-3′ exoribonuclease met verschillende belangrijke biologische rollen die meerdere soorten RNA afbreken, waaronder geoxideerd RNA22. Het bleek dat de processiviteit van het enzym stagneert bij het tegenkomen van 8-oxoG, wat leidde tot RNA-fragmenten met 5′-gefosforyleerde uiteinden [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], en [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Ten slotte is het belangrijk op te merken dat massaspectrometrie een krachtige methode is die, door middel van verschillende methodologieën, kan worden aangepast aan andere doeleinden23,24; daarom is het kiezen van de juiste ionisatiemethode en andere experimentele opstellingen van het grootste belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste uitdaging in deze workflow lag tussen het afronden van de experimenten en het uitvoeren van de massaspectrometrische analyses. Experimenten werden uitgevoerd en voltooid aan de Universiteit van Colorado Denver en (‘s nachts) verscheept naar de faciliteiten van de Colorado State University. Gegevensverzameling werd uitgevoerd na ontvangst, zoals het gemak biedt. Verschillende onverwachte omstandigheden leidden tot tijdsvertragingen in het proces. In één geval moesten onverwachte instrumentstoringen de m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het is belangrijk op te merken dat dit werk een gezamenlijke inspanning was tussen drie instellingen, twee onderzoeksgroepen en één kernfaciliteit. De verdeling en werklast werden als volgt uitgevoerd: Eiwit (Xrn-1) expressie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Denver (Denver, CO). Oligonucleotidesynthese, kwantificering en experimenten (voornamelijk enzymatische afbraak) werden uitgevoerd aan de Universiteit van Colorado Denver (Denver, CO). Daar werd ook optimalisatie uitgevoerd. MALDI-TOF spotting, acquisitie en analyse werden uitgevoerd in de Analytical Resources Core Facility aan de Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS wil graag een UROP Award (CU Denver) en Eureca-subsidies (CU Denver) voor ondersteuning erkennen. E. G.C. erkent de steun van NIGMS, via R00GM115757. MJER erkent ondersteuning van NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. erkent bron-ID: SCR_021758. Het werk werd ook ondersteund door een Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, van de Henry Dreyfus Foundation.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2′-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5′-mononucleotides by a 5′ leads to 3′ mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
