Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada
Summary
O protocolo aqui demonstra que as vesículas extracelulares podem ser adequadamente separadas de meios de cultura celular condicionados usando cromatografia de exclusão de tamanho.
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) são estruturas ligadas à membrana lipídica de tamanho nanométrico que são liberadas de todas as células, estão presentes em todos os biofluidos e contêm proteínas, ácidos nucleicos e lipídios que refletem a célula-mãe da qual são derivadas. A separação adequada de EVs de outros componentes em uma amostra permite a caracterização de sua carga associada e fornece informações sobre seu potencial como comunicadores intercelulares e biomarcadores não invasivos para inúmeras doenças. No presente estudo, os EVs derivados de oligodendrócitos foram isolados de meios de cultura celular usando uma combinação de técnicas de ponta, incluindo ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para separar os EVs de outras proteínas extracelulares e complexos proteicos. Usando colunas SEC comercialmente disponíveis, os EVs foram separados de proteínas extracelulares liberadas de células de oligodendroglioma humano sob condições de estresse de controle e retículo endoplasmático (RE). Os marcadores canônicos de EV CD9, CD63 e CD81 foram observados nas frações 1-4, mas não nas frações 5-8. GM130, uma proteína do aparelho de Golgi, e a calexina, uma proteína integral do RE, foram utilizadas como marcadores negativos de EV, e não foram observadas em nenhuma fração. Além disso, ao agrupar e concentrar as frações 1-4 como fração EV e as frações 5-8 como fração proteica, observou-se expressão de CD63, CD81 e CD9 na fração EV. A expressão de GM130 ou calexina não foi observada em nenhum dos tipos de fração. As frações agrupadas das condições de estresse de controle e ER foram visualizadas com microscopia eletrônica de transmissão e vesículas foram observadas nas frações EV, mas não nas frações proteicas. Partículas no EV e frações proteicas de ambas as condições também foram quantificadas com análise de rastreamento de nanopartículas. Juntos, esses dados demonstram que a SEC é um método eficaz para separar EVs de meios de cultura de células condicionadas.
Introduction
A explosão de interesse no estudo de vesículas extracelulares (EVs) tem sido acompanhada por grandes avanços nas tecnologias e técnicas usadas para separar e estudar essas partículas heterogêneas de tamanho nano. No tempo desde sua descoberta, há quase quatrodécadas1,2, descobriu-se que essas pequenas estruturas membranosas contêm lipídios, ácidos nucleicos e proteínas bioativos e desempenham papéis importantes na comunicação intercelular 3,4. Os EVs são liberados de todos os tipos de células e, portanto, estão presentes em todos os fluidos biológicos, incluindo plasma sanguíneo e soro, saliva e urina. Os EVs dentro desses fluidos são uma grande promessa de servir como biomarcadores não invasivos para várias doenças, incluindo doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas, cânceres e distúrbios autoimunes 5,6,7. Além disso, estudos mecanicistas in vitro podem ser realizados por meio de técnicas de cultura celular, separando EVs liberados no meio de cultura 3,8,9.
Para entender o papel dos EVs na fisiopatologia da doença, a separação adequada do fluido em que eles são encontrados é primordial. O padrão-ouro para a separação de EV tem sido a ultracentrifugação diferencial (dUC)10, no entanto, técnicas mais sofisticadas surgiram para alcançar uma melhor separação de EVs de outros componentes extracelulares. Algumas dessas técnicas incluem gradientes de densidade, fração de fluxo assimétrico de campo-fluxo (A4F), citometria de fluxo, imunocaptura, precipitação de polietilenoglicol e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)11,12,13. Cada técnica tem seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens; no entanto, a SEC, em particular, demonstrou separar os EVs de fluidos biológicos e sobrenadantes de cultura celular de forma bastante eficaz 8,14,15. A SEC também tem o bônus adicional de ser relativamente direta e fácil de usar.
SEC é um método que separa componentes de um fluido com base no tamanho. Com esta técnica, uma coluna de resina (feita internamente ou comprada comercialmente) é usada para fracionar uma amostra. Pequenas partículas na amostra ficam presas entre as contas dentro da resina, enquanto partículas maiores são capazes de passar pela resina mais livremente e, assim, eluir no início do processo. Como os EVs são maiores em tamanho do que muitas proteínas extracelulares e agregados proteicos, os EVs passam pela coluna mais rapidamente e eluem em frações mais precoces do que as proteínas extracelulares14.
Neste artigo de métodos, o uso de SEC para a separação de EVs de meios de cultura celular (CCM) de oligodendrócitos humanos sob condições de estresse de controle e retículo endoplasmático (RE) é descrito. Usando este protocolo, mostra-se que os EVs separados com esta técnica são encontrados dentro de frações específicas que podem ser agrupadas e concentradas para caracterização a jusante, e que os EVs separados são derivados de células e não de uma fonte exógena, como o soro fetal bovino (FBS) usado para complementar o CCM. A presença dos marcadores canônicos de EV, CD63, CD81 e CD916,17,18,19 nas frações EV, e sua ausência nas frações proteicas é demonstrada com western blotting. Usando microscopia eletrônica de transmissão (MET), os EVs são visualizados e exibem a morfologia esperada e são observados apenas na fração EV. As partículas também são contadas nas frações EV e proteína das condições de tensão de controle e ER, e um grande número de partículas dentro da faixa de tamanho esperada de 50-200 nm de diâmetro é observado nas amostras de EV. Juntos, esses dados apoiam a noção de que a SEC é um método eficiente e eficaz para separar os VEs dos meios de cultura celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC é um método fácil de usar para separar adequadamente EVs de CCM condicionado. A fim de isolar especificamente os EVs derivados de células, deve-se levar em conta uma consideração cuidadosa do tipo de CCM e seus suplementos. Muitos meios de cultura celular precisam ser suplementados com FBS, que contém EVs derivados do animal em que o soro foi colhido. Esses EVs séricos podem saturar e mascarar qualquer sinal produzido por EVs derivados de células em cultura26. Portanto, ao realizar ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer à Penn State Behrend e à Hamot Health Foundation pelo financiamento, bem como à Penn State Microscopy Facility em University Park, PA.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
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