Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados

La explosión de interés en el estudio de vesículas extracelulares (EV) ha ido acompañada de importantes avances en las tecnologías y técnicas utilizadas para separar y estudiar estas partículas heterogéneas de tamaño nanométrico. En el tiempo transcurrido desde su descubrimiento hace casi cuatro décadas^1,2, se ha encontrado que estas pequeñas estructuras membranosas contienen lípidos bioactivos, ácidos nucleicos y proteínas, y desempeñan un papel importante en la comunicación intercelular ^3,4. Los EV se liberan de todos los tipos de células y, por lo tanto, están presentes en todos los fluidos biológicos, incluidos el plasma sanguíneo y el suero, la saliva y la orina. Los EV dentro de estos fluidos son muy prometedores para servir como biomarcadores no invasivos para diversas enfermedades, incluidas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas, cánceres y trastornos autoinmunes ^5,6,7. Además, se pueden realizar estudios mecanicistas in vitro mediante técnicas de cultivo celular separando las EV liberadas en el medio de cultivo ^3,8,9.

Para comprender el papel de las EV en la fisiopatología de la enfermedad, es primordial una separación adecuada del líquido en el que se encuentran. El estándar de oro para la separación de EV ha sido durante mucho tiempo la ultracentrifugación diferencial (dUC)¹⁰, sin embargo, han surgido técnicas más sofisticadas para lograr una mejor separación de los EV de otros componentes extracelulares. Algunas de estas técnicas incluyen gradientes de densidad, fracción de flujo de campo asimétrico (A4F), citometría de flujo, inmunocaptura, precipitación de polietilenglicol y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)^11,12,13. Cada técnica tiene su propio conjunto de ventajas y desventajas; sin embargo, se ha demostrado que la SEC en particular separa los EV de los fluidos biológicos y los sobrenadantes de cultivo celular de manera bastante efectiva 8,14,15. SEC también tiene la ventaja adicional de ser relativamente sencillo y fácil de usar.

SEC es un método que separa los componentes de un fluido en función del tamaño. Con esta técnica, se utiliza una columna de resina (ya sea hecha internamente o comprada comercialmente) para fraccionar una muestra. Las partículas pequeñas en la muestra quedan atrapadas entre las perlas dentro de la resina, mientras que las partículas más grandes pueden pasar a través de la resina más libremente y, por lo tanto, eluir antes en el proceso. Debido a que los EV son más grandes en tamaño que muchas proteínas extracelulares y agregados de proteínas, los EV pasan a través de la columna más rápido y eluyen en fracciones más tempranas que las proteínas extracelulares¹⁴.

En este documento de métodos, se describe el uso de SEC para la separación de EV de medios de cultivo celular (CCM) de oligodendrocitos humanos bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico (RE) y control. Usando este protocolo, se muestra que los EV separados con esta técnica se encuentran dentro de fracciones específicas que pueden agruparse y concentrarse para la caracterización posterior, y que los EV separados se derivan de células y no de una fuente exógena como el suero bovino fetal (FBS) utilizado para complementar el CCM. La presencia de los marcadores canónicos de EV, CD63, CD81 y CD9^16,17,18,19 en las fracciones EV^, y su ausencia en las fracciones proteicas se demuestra con western blotting. Usando microscopía electrónica de transmisión (TEM), los EV se visualizan y muestran la morfología esperada y solo se observan en la fracción EV. Las partículas también se cuentan en las fracciones EV y proteica de las condiciones de estrés de control y ER, y se observa un gran número de partículas dentro del rango de tamaño esperado de 50-200 nm de diámetro en las muestras EV. Juntos, estos datos apoyan la noción de que SEC es un método eficiente y efectivo para separar los EV de los medios de cultivo celular.