Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien
Summary
Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind lipidmembrangebundene Strukturen in Nanogröße, die von allen Zellen freigesetzt werden, in allen Bioflüssigkeiten vorhanden sind und Proteine, Nukleinsäuren und Lipide enthalten, die die Mutterzelle widerspiegeln, von der sie abgeleitet sind. Die richtige Trennung von EVs von anderen Komponenten in einer Probe ermöglicht die Charakterisierung ihrer zugehörigen Fracht und gibt Einblick in ihr Potenzial als interzelluläre Kommunikatoren und nicht-invasive Biomarker für zahlreiche Krankheiten. In der aktuellen Studie wurden aus Oligodendrozyten gewonnene EVs aus Zellkulturmedien isoliert, wobei eine Kombination modernster Techniken, einschließlich Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC), verwendet wurde, um EVs von anderen extrazellulären Proteinen und Proteinkomplexen zu trennen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher SEC-Säulen wurden EVs von extrazellulären Proteinen getrennt, die aus menschlichen Oligodendrogliom-Zellen sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) -Stressbedingungen freigesetzt wurden. Die kanonischen EV-Marker CD9, CD63 und CD81 wurden in den Fraktionen 1-4 beobachtet, nicht jedoch in den Fraktionen 5-8. GM130, ein Protein des Golgi-Apparates, und Calnexin, ein integrales Protein des ER, wurden als negative EV-Marker verwendet und in keiner Fraktion beobachtet. Ferner wurde beim Pooling und der Konzentration der Fraktionen 1-4 als EV-Fraktion und der Fraktionen 5-8 als Proteinfraktion die Expression von CD63, CD81 und CD9 in der EV-Fraktion beobachtet. Die Expression von GM130 oder Calnexin wurde bei keinem der Fraktionstypen beobachtet. Die gepoolten Fraktionen sowohl aus Kontroll- als auch aus ER-Stressbedingungen wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert und Vesikel wurden in den EV-Fraktionen, aber nicht in den Proteinfraktionen beobachtet. Partikel in den EV- und Proteinfraktionen aus beiden Bedingungen wurden ebenfalls mit einer Nanopartikel-Tracking-Analyse quantifiziert. Zusammen zeigen diese Daten, dass SEC eine effektive Methode zur Trennung von EVs aus konditionierten Zellkulturmedien ist.
Introduction
Die Explosion des Interesses an der Untersuchung extrazellulärer Vesikel (EVs) wurde von großen Fortschritten in den Technologien und Techniken begleitet, die zur Trennung und Untersuchung dieser nanogroßen, heterogenen Partikel verwendet werden. In der Zeit seit ihrer Entdeckung vor fast vier Jahrzehnten1,2 wurde festgestellt, dass diese kleinen membranösen Strukturen bioaktive Lipide, Nukleinsäuren und Proteine enthalten und eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen 3,4. EVs werden von allen Zelltypen freigesetzt und sind daher in allen biologischen Flüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blutplasma und Serum, Speichel und Urin. EVs in diesen Flüssigkeiten sind vielversprechend, um als nicht-invasive Biomarker für verschiedene Krankheiten zu dienen, einschließlich neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Erkrankungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen 5,6,7. Ferner können mechanistische In-vitro-Studien durch Zellkulturtechniken durchgeführt werden, indem in das Kulturmedium 3,8,9 freigesetzte EVs getrennt werden.
Um die Rolle von EVs in der Krankheitspathophysiologie zu verstehen, ist eine angemessene Trennung von der Flüssigkeit, in der sie gefunden werden, von größter Bedeutung. Der Goldstandard für die EV-Trennung ist seit langem die differentielle Ultrazentrifugation (dUC)10, jedoch sind ausgefeiltere Techniken entstanden, um eine bessere Trennung von EVs von anderen extrazellulären Komponenten zu erreichen. Einige dieser Techniken umfassen Dichtegradienten, asymmetrische Flussfeldflussfraktion (A4F), Durchflusszytometrie, Immuneinfang, Polyethylenglykolfällung und Größenausschlusschromatographie (SEC) 11,12,13. Jede Technik hat ihre eigenen Vor- und Nachteile; Es wurde jedoch gezeigt, dass insbesondere SEC EVs sowohl von biologischen Flüssigkeiten als auch von Zellkulturüberständen recht effektiv trennt 8,14,15. SEC hat auch den zusätzlichen Vorteil, relativ einfach und benutzerfreundlich zu sein.
SEC ist eine Methode, die Komponenten einer Flüssigkeit basierend auf der Größe trennt. Bei dieser Technik wird eine Harzsäule (entweder intern hergestellt oder kommerziell gekauft) verwendet, um eine Probe zu fraktionieren. Kleine Partikel in der Probe werden zwischen den Perlen im Harz eingeschlossen, während größere Partikel das Harz freier passieren und somit früher im Prozess eluieren können. Da EVs größer sind als viele extrazelluläre Proteine und Proteinaggregate, passieren EVs die Säule schneller und eluieren in früheren Fraktionen als extrazelluläre Proteine14.
In diesem Methodenpapier wird die Verwendung von SEC zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien (CCM) aus menschlichen Oligodendrozyten sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) Stressbedingungen skizziert. Unter Verwendung dieses Protokolls wird gezeigt, dass EVs, die mit dieser Technik getrennt werden, in bestimmten Fraktionen gefunden werden, die für die nachgeschaltete Charakterisierung zusammengefasst und konzentriert werden können, und dass die getrennten EVs aus Zellen stammen und nicht aus einer exogenen Quelle wie fetalem Rinderserum (FBS), das zur Ergänzung des CCM verwendet wird. Das Vorhandensein der kanonischen EV-Marker CD63, CD81 und CD916,17,18,19 in den EV-Fraktionen und ihre Abwesenheit in den Proteinfraktionen wird mit Western Blotting nachgewiesen. Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) werden EVs sichtbar gemacht und zeigen die erwartete Morphologie und werden nur in der EV-Fraktion beobachtet. Partikel werden auch in den EV- und Proteinfraktionen sowohl der Kontroll- als auch der ER-Stressbedingungen gezählt, und eine große Anzahl von Partikeln innerhalb des erwarteten Größenbereichs von 50-200 nm Durchmesser wird in den EV-Proben beobachtet. Zusammen unterstützen diese Daten die Vorstellung, dass SEC eine effiziente und effektive Methode zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC ist eine benutzerfreundliche Methode zur adäquaten Trennung von Elektrofahrzeugen von konditioniertem CCM. Um zellabgeleitete EVs spezifisch zu isolieren, muss eine sorgfältige Berücksichtigung der Art des CCM und seiner Ergänzungen berücksichtigt werden. Viele Zellkulturmedien müssen mit FBS ergänzt werden, das EVs enthält, die von dem Tier stammen, bei dem das Serum geerntet wurde. Diese Serum-EVs können jedes Signal sättigen und maskieren, das von EVs erzeugt wird, die von Zellen in Kultur<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Penn State Behrend und der Hamot Health Foundation für die Finanzierung sowie der Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
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