כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית
Summary
הפרוטוקול כאן מדגים כי ניתן להפריד כראוי שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיה מותנית של תרביות תאים באמצעות כרומטוגרפיה של הרחקת גודל.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים הקשורים לממברנות ליפידים בגודל ננומטרי המשתחררים מכל התאים, נמצאים בכל הביופלואידים ומכילים חלבונים, חומצות גרעין ושומנים המשקפים את תא האב שממנו הם נגזרים. הפרדה נכונה של כלי רכב חשמליים מרכיבים אחרים במדגם מאפשרת אפיון של המטען הקשור אליהם ומעניקה תובנה לגבי הפוטנציאל שלהם כמתקשרים בין-תאיים וסמנים ביולוגיים לא פולשניים למחלות רבות. במחקר הנוכחי, כלי רכב חשמליים שמקורם באוליגודנדרוציטים בודדו ממדיית תרביות תאים באמצעות שילוב של טכניקות חדישות, כולל אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל (SEC) כדי להפריד בין כלי רכב חשמליים לבין חלבונים חוץ-תאיים אחרים וקומפלקסים של חלבונים. באמצעות עמודי SEC הזמינים מסחרית, הופרדו כלי רכב חשמליים מחלבונים חוץ-תאיים ששוחררו מתאי אוליגודנדרוגליומה אנושיים בתנאי בקרה ותנאי עקה אנדופלסמית רשתית (ER). סמני EV קנוניים CD9, CD63 ו- CD81 נצפו בשברים 1-4, אך לא בשברים 5-8. GM130, חלבון של מנגנון גולג’י, וקלקסין, חלבון אינטגרלי של ER, שימשו כסמני EV שליליים, ולא נצפו בשום שבר. יתר על כן, בעת איגום וריכוז שברים 1-4 כשבר EV, ושברים 5-8 כשבר החלבון, נצפה ביטוי של CD63, CD81 ו- CD9 בשבר EV. הביטוי של GM130 או calnexin לא נצפה באף אחד מסוגי השברים. השברים המאוגדים הן מתנאי הבקרה והן מתנאי ה-ER הודגמו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה ושלפוחיות נצפו בשברים EV, אך לא בשברים החלבונים. חלקיקים ב-EV ושברי חלבונים משני התנאים כומתו גם הם באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. יחד, נתונים אלה מראים כי SEC היא שיטה יעילה להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה מותנית של תרביות תאים.
Introduction
התפוצצות העניין בחקר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) לוותה בהתקדמות משמעותית בטכנולוגיות ובטכניקות המשמשות להפרדה ולמחקר של חלקיקים הטרוגניים בגודל ננומטרי. בזמן שחלף מאז גילוים לפני כמעט ארבעה עשורים1,2, נמצא כי מבנים ממברניים קטנים אלה מכילים שומנים ביו-אקטיביים, חומצות גרעין וחלבונים, וממלאים תפקידים מרכזיים בתקשורת בין-תאית 3,4. כלי רכב חשמליים משתחררים מכל סוגי התאים ולכן נמצאים בכל הנוזלים הביולוגיים, כולל פלסמה וסרום, רוק ושתן. כלי רכב חשמליים בתוך נוזלים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה לשמש כסמנים ביולוגיים לא פולשניים למחלות שונות, כולל מחלות נוירו-דלקתיות ומחלות נוירודגנרטיביות, סרטן והפרעות אוטואימוניות 5,6,7. יתר על כן, ניתן לבצע מחקרים מכניסטיים במבחנה באמצעות טכניקות של תרביות תאים על ידי הפרדת כלי רכב חשמליים המשתחררים למדיום התרבית 3,8,9.
כדי להבין את תפקידם של כלי רכב חשמליים בפתופיזיולוגיה של מחלות, הפרדה נאותה מהנוזל שבו הם נמצאים היא בעלת חשיבות עליונה. תקן הזהב להפרדת EV הוא זה מכבר אולטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית (dUC)10, אולם נוצרו טכניקות מתוחכמות יותר להשגת הפרדה טובה יותר של כלי רכב חשמליים מרכיבים חוץ-תאיים אחרים. חלק מטכניקות אלה כוללות מעברי צבע של צפיפות, שבר זרימת שדה אסימטרי-זרימה (A4F), ציטומטריה של זרימה, אימונוקסטור, משקעי פוליאתילן גליקול וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)11,12,13. לכל טכניקה יש קבוצה משלה של יתרונות וחסרונות; עם זאת, הוכח כי SEC בפרט מפריד בין כלי רכב חשמליים לבין נוזלים ביולוגיים ותרבי-על של תרביות תאים בצורה יעילה למדי 8,14,15. ל-SEC יש גם את הבונוס הנוסף של היותה פשוטה יחסית וידידותית למשתמש.
SEC היא שיטה המפרידה בין רכיבים של נוזל בהתבסס על גודל. עם טכניקה זו, עמודה של שרף (או עשה בתוך הבית או נרכש מסחרית) משמש כדי לחלק מדגם. חלקיקים קטנים בדגימה נלכדים בין החרוזים בתוך השרף, בעוד שחלקיקים גדולים יותר מסוגלים לעבור דרך השרף בחופשיות רבה יותר, וכך לחמוק מוקדם יותר בתהליך. מאחר שרכבים חשמליים גדולים יותר בגודלם מחלבונים חוץ-תאיים רבים ומאגרגטים של חלבונים, כלי רכב חשמליים עוברים דרך העמודה מהר יותר ומתחמקים בשברים מוקדמים יותר מאשר חלבונים חוץ-תאיים14.
במאמר שיטות זה, מתואר השימוש ב-SEC להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים (CCM) מאוליגודנדרוציטים אנושיים תחת בקרה ותנאי עקה אנדופלסמיים של הרשתית (ER). באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי כלי רכב חשמליים המופרדים בטכניקה זו נמצאים בתוך שברים ספציפיים שניתן לאגד יחד ולרכז לאפיון במורד הזרם, וכי כלי הרכב החשמליים המופרדים מופקים מתאים ולא ממקור אקסוגני כגון סרום בקר עוברי (FBS) המשמש להשלמת CCM. נוכחותם של סמני EV קנוניים, CD63, CD81 ו- CD916,17,18,19 בשברים EV, והיעדרם בשברי החלבון מודגמת בכתם מערבי. באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM), כלי רכב חשמליים מוצגים באופן חזותי ומציגים את המורפולוגיה הצפויה ונצפים רק בחלק EV. חלקיקים נספרים גם בשברי EV וחלבון של תנאי בקרה ו-ER, ומספר רב של חלקיקים בטווח הגודל הצפוי של 50-200 ננומטר בקוטר נצפו בדגימות EV. יחד, נתונים אלה תומכים ברעיון ש-SEC היא שיטה יעילה ואפקטיבית להפרדת כלי רכב חשמליים ממדיה של תרביות תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC היא שיטה ידידותית למשתמש להפרדה נאותה של כלי רכב חשמליים מ-CCM מותנה. על מנת לבודד באופן ספציפי רכבים חשמליים שמקורם בתאים, יש לקחת בחשבון שיקול דעת זהיר של סוג CCM ותוספי התזונה שלו. מדיות רבות של תרביות תאים צריכות להיות משלימות FBS, המכילות כלי רכב חשמליים שמקורם בחיה שבה נקטף הסרום. כלי רכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לפן סטייט בהרנד ולקרן הבריאות Hamot על המימון, כמו גם למתקן המיקרוסקופיה של פן סטייט ביוניברסיטי פארק, פנסילבניה.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
- Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
- Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
- Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
- Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
- O’Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
- Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
- Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
- Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles’ characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
- Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
- Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
- Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
- Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
- Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
