Эксклюзионная хроматография для отделения внеклеточных везикул от кондиционированных клеточных культуральных сред

Взрыв интереса к изучению внеклеточных везикул (EV) сопровождался значительными достижениями в технологиях и методах, используемых для разделения и изучения этих наноразмерных гетерогенных частиц. За время, прошедшее с момента их открытия почти четыре десятилетия назад ^1,2, было обнаружено, что эти небольшие мембранные структуры содержат биологически активные липиды, нуклеиновые кислоты и белки и играют важную роль в межклеточной коммуникации ^3,4. EV высвобождаются из всех типов клеток и, следовательно, присутствуют во всех биологических жидкостях, включая плазму крови и сыворотку, слюну и мочу. Ev в этих жидкостях имеют большие перспективы служить неинвазивными биомаркерами для различных заболеваний, включая нейровоспалительные и нейродегенеративные заболевания, рак и аутоиммунные расстройства ^5,6,7. Кроме того, механистические исследования in vitro могут быть выполнены с помощью методов клеточной культуры путем разделения EV, высвобождаемых в^{культуральную среду 3,8,9}.

Чтобы понять роль EV в патофизиологии заболеваний, адекватное отделение от жидкости, в которой они находятся, имеет первостепенное значение. Золотым стандартом для разделения электромобилей уже давно является дифференциальное ультрацентрифугирование (dUC)¹⁰, однако возникли более сложные методы для достижения лучшего отделения EV от других внеклеточных компонентов. Некоторые из этих методов включают градиенты плотности, асимметрично-поточную полевую фракцию потока (A4F), проточную цитометрию, иммунозахват, осаждение полиэтиленгликоля и хроматографию с исключением размеров (SEC)11,12,13. Каждая методика имеет свой набор преимуществ и недостатков; тем не менее, было показано, что SEC, в частности, отделяет EV как от биологических жидкостей, так и от супернатантов клеточных культур довольно эффективно ^8,14,15. SEC также имеет дополнительный бонус в том, что он относительно прост и удобен для пользователя.

SEC – это метод, который разделяет компоненты жидкости на основе размера. С помощью этого метода столб смолы (либо изготовленный собственными силами, либо приобретенный на коммерческой основе) используется для фракционирования образца. Мелкие частицы в образце попадают в ловушку между шариками внутри смолы, в то время как более крупные частицы способны проходить через смолу более свободно и, таким образом, элюироваться раньше в процессе. Поскольку EV больше по размеру, чем многие внеклеточные белки и белковые агрегаты, EV проходят через столб быстрее и элюируются в более ранних фракциях, чем внеклеточные белки¹⁴.

В данной работе по методам изложено использование SEC для отделения EV от клеточных культуральных сред (CCM) от олигодендроцитов человека как под контролем, так и в условиях стресса эндоплазматического ретикулума (ER). Используя этот протокол, показано, что EV, разделенные с помощью этого метода, обнаруживаются в определенных фракциях, которые могут быть объединены вместе и сконцентрированы для последующей характеристики, и что разделенные EV получены из клеток, а не из экзогенного источника, такого как фетальная бычья сыворотка (FBS), используемая для дополнения CCM. Наличие канонических ev-маркеров CD63, CD81 и CD9 ^16,17,18,19 в фракциях EV и их отсутствие в белковых фракциях демонстрируется при вестерн-блоттинге. Используя просвечивающую электронную микроскопию (ТЭМ), EV визуализируются и отображают ожидаемую морфологию и наблюдаются только в фракции EV. Частицы также подсчитываются в EV и белковых фракциях как контрольных, так и ER-стрессовых условий, а в образцах EV наблюдается большое количество частиц в пределах ожидаемого диапазона размеров 50-200 нм в диаметре. Вместе эти данные подтверждают представление о том, что SEC является эффективным и действенным методом отделения EV от сред клеточных культур.