Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia
Summary
Het protocol hier toont aan dat extracellulaire blaasjes adequaat kunnen worden gescheiden van geconditioneerde celkweekmedia met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn nano-sized lipide-membraan gebonden structuren die vrijkomen uit alle cellen, aanwezig zijn in alle biovloeistoffen en eiwitten, nucleïnezuren en lipiden bevatten die een weerspiegeling zijn van de moedercel waaruit ze zijn afgeleid. Een goede scheiding van EV’s van andere componenten in een monster maakt karakterisering van hun bijbehorende lading mogelijk en geeft inzicht in hun potentieel als intercellulaire communicatoren en niet-invasieve biomarkers voor tal van ziekten. In de huidige studie werden van oligodendrocyten afgeleide EV’s geïsoleerd uit celkweekmedia met behulp van een combinatie van state-of-the-art technieken, waaronder ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) om EV’s te scheiden van andere extracellulaire eiwitten en eiwitcomplexen. Met behulp van in de handel verkrijgbare SEC-kolommen werden EV’s gescheiden van extracellulaire eiwitten die vrijkwamen uit menselijke oligodendroglioomcellen onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden. De canonieke EV-markers CD9, CD63 en CD81 werden waargenomen in fracties 1-4, maar niet in fracties 5-8. GM130, een eiwit van het Golgi-apparaat, en calnexin, een integraal eiwit van de ER, werden gebruikt als negatieve EV-markers en werden in geen enkele fractie waargenomen. Verder werd bij het poolen en concentreren van fracties 1-4 als de EV-fractie en fracties 5-8 als de eiwitfractie expressie van CD63, CD81 en CD9 in de EV-fractie waargenomen. De expressie van GM130 of calnexin werd niet waargenomen in een van de fractietypen. De gepoolde fracties van zowel controle- als ER-stresscondities werden gevisualiseerd met transmissie-elektronenmicroscopie en blaasjes werden waargenomen in de EV-fracties, maar niet in de eiwitfracties. Deeltjes in de EV en eiwitfracties van beide omstandigheden werden ook gekwantificeerd met nanodeeltjes tracking analyse. Samen tonen deze gegevens aan dat SEC een effectieve methode is voor het scheiden van EV’s van geconditioneerde celkweekmedia.
Introduction
De explosie van interesse in het bestuderen van extracellulaire blaasjes (EV’s) is gepaard gegaan met grote vooruitgang in de technologieën en technieken die worden gebruikt om deze nanogrote, heterogene deeltjes te scheiden en te bestuderen. In de tijd sinds hun ontdekking bijna vier decennia geleden 1,2, zijn deze kleine vliezige structuren gevonden om bioactieve lipiden, nucleïnezuren en eiwitten te bevatten en een belangrijke rol te spelen in intercellulaire communicatie 3,4. EV’s komen vrij uit alle celtypen en zijn daarom aanwezig in alle biologische vloeistoffen, inclusief bloedplasma en serum, speeksel en urine. EV’s in deze vloeistoffen houden een grote belofte in om te dienen als niet-invasieve biomarkers voor verschillende ziekten, waaronder neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten, kankers en auto-immuunziekten 5,6,7. Verder kunnen in vitro mechanistische studies worden uitgevoerd door middel van celkweektechnieken door EV’s te scheiden die vrijkomen in het kweekmedium 3,8,9.
Om de rol van EV’s in de pathofysiologie van ziekten te begrijpen, is een adequate scheiding van de vloeistof waarin ze worden aangetroffen van het grootste belang. De gouden standaard voor EV-scheiding is al lang differentiële ultracentrifugatie (dUC)10, maar er zijn meer geavanceerde technieken ontstaan om een betere scheiding van EV’s van andere extracellulaire componenten te bereiken. Sommige van deze technieken omvatten dichtheidsgradiënten, asymmetrische-flow veldstroomfractie (A4F), flowcytometrie, immunocapture, polyethyleenglycolprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)11,12,13. Elke techniek heeft zijn eigen voor- en nadelen; van SEC in het bijzonder is echter aangetoond dat het EV’s vrij effectief scheidt van zowel biologische vloeistoffen als supernatanten van celkweek 8,14,15. SEC heeft ook de toegevoegde bonus dat het relatief eenvoudig en gebruiksvriendelijk is.
SEC is een methode die componenten van een vloeistof scheidt op basis van grootte. Met deze techniek wordt een kolom hars (in eigen huis gemaakt of commercieel gekocht) gebruikt om een monster te fractioneren. Kleine deeltjes in het monster komen vast te zitten tussen de kralen in de hars, terwijl grotere deeltjes vrijer door de hars kunnen gaan en dus eerder in het proces kunnen elueren. Omdat EV’s groter zijn dan veel extracellulaire eiwitten en eiwitaggregaten, passeren EV’s sneller de kolom en elueren ze in eerdere fracties dan extracellulaire eiwitten14.
In dit methodepaper wordt het gebruik van SEC voor scheiding van EV’s van celkweekmedia (CCM) van menselijke oligodendrocyten onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden geschetst. Met behulp van dit protocol wordt aangetoond dat EV’s gescheiden met deze techniek worden gevonden in specifieke fracties die kunnen worden samengevoegd en geconcentreerd voor downstream karakterisatie, en dat de gescheiden EV’s zijn afgeleid van cellen en niet van een exogene bron zoals foetaal runderserum (FBS) dat wordt gebruikt om de CCM aan te vullen. De aanwezigheid van de canonieke EV-markers, CD63, CD81 en CD9 16,17,18,19 in de EV-fracties, en hun afwezigheid in de eiwitfracties wordt aangetoond met western blotting. Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) worden EV’s gevisualiseerd en geven ze de verwachte morfologie weer en worden ze alleen waargenomen in de EV-fractie. Deeltjes worden ook geteld in de EV- en eiwitfracties van zowel controle- als ER-stressomstandigheden, en een groot aantal deeltjes binnen het verwachte groottebereik van 50-200 nm in diameter wordt waargenomen in de EV-monsters. Samen ondersteunen deze gegevens het idee dat SEC een efficiënte en effectieve methode is voor het scheiden van EV’s van celkweekmedia.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC is een gebruiksvriendelijke methode om EV’s adequaat te scheiden van geconditioneerde CCM. Om specifiek van cellen afgeleide EV’s te isoleren, moet zorgvuldig rekening worden gehouden met het type CCM en de supplementen ervan. Veel celkweekmedia moeten worden aangevuld met FBS, dat EV’s bevat die zijn afgeleid van het dier waarin het serum is geoogst. Deze serum-EV’s kunnen elk signaal dat wordt geproduceerd door EV’s afkomstig van cellen in cultuur verzadigen en maskeren26. Daarom moet bij he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Penn State Behrend en de Hamot Health Foundation bedanken voor financiering, evenals de Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
- Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
- Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
- Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
- Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
- O’Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
- Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
- Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
- Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles’ characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
- Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
- Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
- Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
- Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
- Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
