馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

細胞外小胞(EV)の研究への関心の爆発は、これらのナノサイズの不均一な粒子を分離して研究するために使用される技術と技術の大きな進歩を伴っています。約40年前の発見以来^1,2、これらの小さな膜構造は生理活性脂質、核酸、タンパク質を含み、細胞間コミュニケーションにおいて主要な役割を果たしていることがわかっています^3,4。EVはすべての細胞型から放出されるため、血漿や血清、唾液、尿など、すべての体液に存在します。これらの液体中のEVは、神経炎症性疾患や神経変性疾患、癌、自己免疫疾患など、さまざまな疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能することが大いに期待されています^5,6,7。さらに、インビトロ機構研究は、培養培地^3、8、9に放出されたEVを分離することによって細胞培養技術を通じて行うことができる。

疾患の病態生理におけるEVの役割を理解するには、EVが見つかった液体から適切に分離することが最も重要です。EV分離のゴールドスタンダードは長い間示差超遠心(dUC)¹⁰でしたが、EVを他の細胞外成分からよりよく分離するために、より洗練された技術が生まれています。これらの手法には、密度勾配、非対称フローフィールドフローフラクション(A4F)、フローサイトメトリー、イムノキャプチャー、ポリエチレングリコール沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などがあります^11,12,13。各手法には、独自の長所と短所があります。しかし、特にSECは、生体液と細胞培養上清の両方からEVを非常に効果的に分離することが示されています^8,14,15。SECには、比較的簡単でユーザーフレンドリーであるという追加のボーナスもあります。

SECは、サイズに基づいて流体の成分を分離する方法です。この技術では、樹脂のカラム(社内で製造されたもの、または市販品で購入されたもの)を使用してサンプルを分画します。サンプル中の小さな粒子は樹脂内のビーズの間に閉じ込められますが、大きな粒子は樹脂をより自由に通過できるため、プロセスの早い段階で溶出します。EVは多くの細胞外タンパク質やタンパク質凝集体よりもサイズが大きいため、EVは細胞外タンパク質よりも速くカラムを通過し、早い画分で溶出します¹⁴。

この方法の論文では、コントロールおよび小胞体(ER)ストレス条件の両方の下で、ヒト希突起膠細胞から細胞培養培地(CCM)からEVを分離するためのSECの使用について概説しています。このプロトコルを使用すると、この手法で分離されたEVは、一緒にプールして下流の特性評価のために濃縮できる特定の画分内に見られ、分離されたEVは細胞に由来し、CCMを補完するために使用されるウシ胎児血清(FBS)などの外因性源からではないことが示されています。EV画分における標準的なEVマーカーCD63、CD81、およびCD9^16、17、¹⁸、¹⁹の存在^、およびタンパク質画分におけるそれらの不在は^、ウェスタンブロッティングで実証されています。透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して、EVは視覚化され、期待される形態を示し、EV分画でのみ観察されます。粒子は、対照およびERストレス条件の両方のEVおよびタンパク質画分でもカウントされ、EVサンプルでは直径50〜200nmの予想されるサイズ範囲内の多数の粒子が観察されます。これらのデータを組み合わせることで、SECが細胞培養培地からEVを分離するための効率的かつ効果的な方法であるという考えが裏付けられています。