Desarrollo de organoides a partir de la hipófisis del ratón como modelo in vitro para explorar la biología de las células madre hipofisarias

La hipófisis es una pequeña glándula endocrina ubicada en la base del cerebro, donde está conectada al hipotálamo. La glándula integra entradas periféricas y centrales (hipotalámicas) para generar una liberación hormonal sintonizada y coordinada, regulando así los órganos endocrinos objetivo aguas abajo (como las glándulas suprarrenales y las gónadas) para producir hormonas apropiadas en el momento adecuado. La hipófisis es el regulador clave del sistema endocrino y, por lo tanto, se denomina legítimamente la glándula maestra¹.

La hipófisis del ratón consta de tres lóbulos (Figura 1), es decir, el lóbulo anterior (AL), el lóbulo intermedio (IL) y el lóbulo posterior (PL). El principal AL endocrino contiene cinco tipos de células hormonales, incluidos los somatotropos que producen la hormona del crecimiento (GH); lactotropos generadores de prolactina (PRL); corticótropos que secretan hormona adrenocorticotrópica (ACTH); tirotropos responsables de la producción de hormona estimulante de la tiroides (TSH); y gonadotropos que producen hormona luteinizante (LH) y hormona foliculoestimulante (FSH). El PL consiste en proyecciones axonales del hipotálamo en las que se almacenan las hormonas oxitocina y vasopresina (hormona antidiurética). La IL se encuentra entre el AL y el PL y alberga melanótropos que producen la hormona estimulante de melanocitos (MSH). En la hipófisis humana, la IL retrocede durante el desarrollo, y los melanotropos se propagan dentro de la AL¹. Además de las células endocrinas, la glándula pituitaria también contiene un grupo de células madre, esencialmente marcadas por el factor de transcripción SOX2 2,3,4,5,6. Estas células SOX2⁺ se encuentran en la zona marginal (MZ), el revestimiento epitelial de la hendidura (una luz remanente embrionaria entre la AL y la IL), o se diseminan como grupos a lo largo del parénquima de la AL, proponiendo así dos nichos de células madre en la glándula (Figura 1)2,3,4,5,6.

Dada la naturaleza indispensable de la hipófisis, el mal funcionamiento de la glándula se asocia con una morbilidad grave. El hiperpituitarismo (caracterizado por la secreción excesiva de una o más hormonas) y el hipopituitarismo (producción defectuosa o faltante de una o más hormonas) pueden ser causados por tumores neuroendocrinos hipofisarios (PitNET; por ejemplo, tumores productores de ACTH que conducen a la enfermedad de Cushing) o por defectos genéticos (por ejemplo, deficiencia de GH que resulta en enanismo)⁷. Además, la cirugía hipofisaria (por ejemplo, para extirpar tumores), infecciones (por ejemplo, tuberculosis hipotalámico-hipofisaria o infecciones posteriores a meningitis bacteriana o encefalitis), síndrome de Sheehan (necrosis debido a un flujo sanguíneo insuficiente debido a una gran pérdida de sangre al nacer), apoplejía hipofisaria y lesión cerebral traumática son otras causas importantes de hipofunción hipofisaria⁸ . Se ha demostrado que la hipófisis del ratón posee la capacidad regenerativa, siendo capaz de reparar el daño local introducido por la ablación transgénica de células endocrinas ^9,10. Las células madre SOX2⁺ reaccionan agudamente a la lesión infligida mostrando un fenotipo activado, marcado por una mayor proliferación (lo que resulta en la expansión de las células madre) y una mayor expresión de factores y vías relacionados con la madre (por ejemplo, WNT / NOTCH). Además, las células madre comienzan a expresar la hormona ablacionada, lo que finalmente resulta en una restauración sustancial de la población celular agotada durante los siguientes (5 a 6) meses ^9,10. Además, durante la fase de maduración neonatal de la glándula (las primeras 3 semanas después del nacimiento), las células madre hipofisarias prosperan en un estado activado 6,11,12,13, mientras que el envejecimiento del organismo se asocia con una disminución de la funcionalidad de las células madre in situ, debido a un entorno inflamatorio (micro) creciente en el envejecimiento (o ‘inflamación’)^10,14 . Además, la tumorigénesis en la glándula también se asocia con la activación de células madre ^7,15. Aunque la activación de células madre se ha detectado en varias situaciones de remodelación hipofisaria (revisado en ^7,16), los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Dado que los enfoques in vivo (como el rastreo de linaje en ratones transgénicos) no han proporcionado una imagen clara o completa de las células madre hipofisarias, el desarrollo de modelos in vitro confiables para explorar la biología de las células madre en la hipófisis normal y enferma es esencial. El cultivo in vitro estándar de células madre hipofisarias primarias sigue siendo inadecuado debido a la capacidad de crecimiento muy limitada y las condiciones no fisiológicas (2D) con una rápida pérdida del fenotipo (para una visión general más detallada, ver¹⁶). Se han establecido cultivos de esferas 3D (pituisferas) a partir de células madre hipofisarias identificadas por población lateral y fenotipo^{SOX2+ 2,3,4}. Las pituiesferas crecen clonalmente a partir de las células madre, expresan marcadores de tallo y muestran capacidad de diferenciación en los tipos de células endocrinas. Sin embargo, no se expanden considerablemente mientras muestran solo una pasadibilidad limitada (2-3 pasajes)^3,4. También se obtuvieron estructuras en forma de esfera a partir de grupos de células madre hipofisarias no disociadas cuando se cultivaron en Matrigel diluido al 50% durante 1 semana, pero no se mostró capacidad de expansión¹⁷. El enfoque de la pituisfera se utiliza principalmente como una herramienta de lectura para el número de células madre, pero las aplicaciones adicionales están limitadas por una capacidad de expansión inferior¹⁶.

Para abordar y superar estas deficiencias, recientemente se ha establecido un nuevo modelo 3D, es decir, organoides, a partir de la principal AL endocrina de ratones que contienen la MZ y las células madre parenquimatosas. Se ha demostrado que los organoides se derivan de las células madre de la hipófisis y recapitulan fielmente su fenotipo¹⁸. Además, los organoides son expandibles a largo plazo, mientras que mantienen robustamente su naturaleza de tallo. Por lo tanto, proporcionan un método confiable para expandir las células madre hipofisarias primarias para una exploración profunda. Tal exploración no es alcanzable con el número limitado de células madre que se pueden aislar de una hipófisis, que tampoco son expandibles en condiciones 2D¹⁶. Se ha demostrado que los organoides son herramientas valiosas y fiables para descubrir nuevas características de las células madre hipofisarias (traducibles a in vivo)^14,18. Es importante destacar que el modelo organoide refleja fielmente el estado de activación de las células madre hipofisarias como ocurre durante el daño tisular local y la maduración neonatal, mostrando una mayor eficiencia de formación y replicando las vías moleculares reguladas al alza^14,18. Por lo tanto, el modelo organoide derivado de la hipófisis es un modelo de investigación de biología de células madre hipofisarias innovador y poderoso, así como una herramienta de lectura de activación de células madre.

Este protocolo describe en detalle el establecimiento de organoides derivados de la hipófisis del ratón. Con este objetivo, la AL se aísla y se disocia en células individuales, que están incrustadas en Matrigel que imita la matriz extracelular (en adelante, ECM). El ensamblaje célula-ECM se cultiva en un medio definido, que contiene esencialmente factores de crecimiento de células madre y reguladores embrionarios hipofisarios (también denominado “medio organoide hipofisario” (PitOM)¹⁸; Tabla 1). Una vez que los organoides están completamente desarrollados (después de 10-14 días), pueden expandirse aún más a través del pasaje secuencial y someterse a una extensa exploración aguas abajo (por ejemplo, inmunofluorescencia, RT-qPCR y transcriptómica a granel o de una sola célula; Figura 1). A largo plazo, se espera que los organoides de células madre hipofisarias allanen el camino hacia los enfoques de reparación de tejidos y la medicina regenerativa.