Разработка органоидов из мышиного гипофиза в качестве модели in vitro для изучения биологии стволовых клеток гипофиза
Summary
Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы организма. В этой статье описывается развитие органоидов из гипофиза мыши как новой 3D-модели in vitro для изучения популяции стволовых клеток железы, биология и функция которой остаются плохо изученными.
Abstract
Гипофиз является главной эндокринной железой, регулирующей ключевые физиологические процессы, включая рост тела, обмен веществ, половое созревание, размножение и реакцию на стресс. Более десяти лет назад стволовые клетки были идентифицированы в гипофизе. Однако, несмотря на применение трансгенных подходов in vivo , их фенотип, биология и роль остаются неясными. Чтобы справиться с этой загадкой, разработана новая и инновационная органоидная модель in vitro , чтобы глубоко разгадать биологию стволовых клеток гипофиза. Органоиды представляют собой 3D-клеточные структуры, которые при определенных условиях культивирования самостоятельно развиваются из стволовых клеток ткани (эпителия) и повторяют множественные признаки этих стволовых клеток и их ткани. Здесь показано, что органоиды, полученные из гипофиза мыши, развиваются из стволовых клеток железы и точно повторяют их фенотипические и функциональные характеристики in vivo . Среди прочего, они воспроизводят состояние активации стволовых клеток in vivo, происходящее в ответ на трансгенно нанесенное местное повреждение. Органоиды являются долгосрочными расширяемыми, сохраняя при этом свой фенотип ствола. Новая исследовательская модель очень ценна для расшифровки фенотипа и поведения стволовых клеток во время ключевых условий ремоделирования гипофиза, начиная от созревания новорожденных до связанного со старением увядания, и от здоровых до больных желез. Здесь представлен подробный протокол для установления органоидов, полученных из гипофиза мыши, которые обеспечивают мощный инструмент для погружения в еще загадочный мир стволовых клеток гипофиза.
Introduction
Гипофиз представляет собой крошечную эндокринную железу, расположенную у основания мозга, где она связана с гипоталамусом. Железа интегрирует периферические и центральные (гипоталамические) входы для генерации настроенного и скоординированного высвобождения гормонов, тем самым регулируя последующие эндокринные органы-мишени (такие как надпочечники и гонады) для производства соответствующих гормонов в нужное время. Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы и поэтому по праву называется главной железой1.
Гипофиз мыши состоит из трех долей (рисунок 1), то есть передней доли (AL), промежуточной доли (IL) и задней доли (PL). Основная эндокринная AL содержит пять типов гормональных клеток, включая соматотропы, которые производят гормон роста (ГР); лактотропы, генерирующие пролактин (ПРЛ); кортикотропы, секретирующие адренокортикотропный гормон (АКТГ); тиреотропы, отвечающие за выработку тиреотропного гормона (ТТГ); и гонадотропы, вырабатывающие лютеинизирующий гормон (ЛГ) и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). PL состоит из аксональных проекций из гипоталамуса, в которых хранятся гормоны окситоцин и вазопрессин (антидиуретический гормон). IL расположен между AL и PL и содержит меланотропы, которые производят меланоцитостимулирующий гормон (MSH). В гипофизе человека IL регрессирует во время развития, и меланотропы распространяются в пределах AL1. Помимо эндокринных клеток, гипофиз также содержит пул стволовых клеток, по существу отмеченных транскрипционным фактором SOX2 2,3,4,5,6. Эти клетки SOX2+ расположены в маргинальной зоне (MZ), эпителиальной выстилке расщелины (эмбриональный остаточный просвет между AL и IL), или распространяются в виде кластеров по всей паренхиме AL, тем самым предлагая две ниши стволовых клеток в железе (рисунок 1)2,3,4,5,6.
Учитывая незаменимый характер гипофиза, нарушение работы железы связано с серьезной заболеваемостью. Гиперпитуитаризм (характеризующийся чрезмерной секрецией одного или нескольких гормонов) и гипопитуитаризм (дефектная или отсутствующая выработка одного или нескольких гормонов) могут быть вызваны нейроэндокринными опухолями гипофиза (PitNETs; например, опухоли, продуцирующие АКТГ, приводящие к болезни Кушинга) или генетическими дефектами (например, дефицит ГР, приводящий к карликовости)7. Кроме того, хирургия гипофиза (например, для удаления опухолей), инфекции (например, туберкулез гипоталамо-гипофиза или инфекции, следующие за бактериальным менингитом или энцефалитом), синдром Шихана (некроз из-за недостаточного кровотока из-за сильной кровопотери при родах), апоплексия гипофиза и черепно-мозговая травма являются другими важными причинами гипофайнкции гипофиза8 . Показано, что гипофиз мыши обладает регенеративной способностью, будучи способным восстанавливать локальные повреждения, внесенные трансгенной абляцией эндокринных клеток 9,10. Стволовые клетки SOX2+ остро реагируют на нанесенное повреждение, демонстрируя активированный фенотип, отмеченный усиленной пролиферацией (что приводит к расширению стволовых клеток) и повышенной экспрессией факторов и путей, связанных со стволовой (например, WNT / NOTCH). Более того, стволовые клетки начинают экспрессировать абляционный гормон, что в конечном итоге приводит к существенному восстановлению истощенной клеточной популяции в течение следующих (от 5 до 6) месяцев 9,10. Кроме того, во время фазы неонатального созревания железы (первые 3 недели после рождения) стволовые клетки гипофиза процветают в активированном состоянии 6,11,12,13, тогда как старение организма связано со снижением функциональности стволовых клеток in situ из-за увеличения воспалительной (микро-) среды при старении (или «воспалении»)10,14 . Кроме того, опухолевый генез в железе также связан с активацией стволовых клеток 7,15. Хотя активация стволовых клеток была обнаружена в нескольких ситуациях ремоделирования гипофиза (рассмотренных в 7,16), основные механизмы остаются неясными. Поскольку подходы in vivo (такие как отслеживание родословной у трансгенных мышей) не дают четкой или всеобъемлющей картины стволовых клеток гипофиза, разработка надежных моделей in vitro для изучения биологии стволовых клеток в нормальном и больном гипофизе имеет важное значение. Стандартная культура in vitro первичных стволовых клеток гипофиза остается неадекватной из-за очень ограниченной способности к росту и нефизиологических (2D) условий с быстрой потерей фенотипа (для более подробного обзора см.16). 3D-сферные культуры (питуисферы) были созданы из стволовых клеток гипофиза, идентифицированных по боковой популяции и фенотипуSOX2+ 2,3,4. Питуисферы клонально растут из стволовых клеток, экспрессируют маркеры стволовости и демонстрируют дифференцировочную способность в эндокринные типы клеток. Однако они существенно не расширяются, показывая лишь ограниченную проходимость (2-3 прохода)3,4. Сфероподобные структуры также были получены из недиссоциированных кластеров стволовых клеток гипофиза при культивировании в 50% разбавленном Матригеле в течение 1 недели, но расширяемость не была показана17. Подход питуисферы в основном используется в качестве инструмента считывания числа стволовых клеток, но дальнейшие применения ограничены более низкой расширительной способностью16.
Чтобы устранить и преодолеть эти недостатки, недавно была создана новая 3D-модель, то есть органоиды, начиная с основного эндокринного AL мышей, содержащих MZ и паренхиматозные стволовые клетки. Было показано, что органоиды действительно получены из стволовых клеток гипофиза и точно повторяют их фенотип18. Кроме того, органоиды являются долгосрочными расширяемыми, при этом надежно сохраняя свою стеблевую природу. Поэтому они обеспечивают надежный метод расширения первичных стволовых клеток гипофиза для глубокого исследования. Такое исследование недостижимо при ограниченном количестве стволовых клеток, которые могут быть выделены из гипофиза, которые также не могут быть расширены в 2D-условиях16. Было показано, что органоиды являются ценными и надежными инструментами для выявления новых особенностей стволовых клеток гипофиза (переводимых в in vivo)14,18. Важно отметить, что органоидная модель точно отражает статус активации стволовых клеток гипофиза, возникающий во время локального повреждения тканей и созревания новорожденных, демонстрируя повышенную эффективность формирования и репликацию регулируемых молекулярных путей14,18. Следовательно, органоидная модель, полученная из гипофиза, является инновационной и мощной исследовательской моделью биологии стволовых клеток гипофиза, а также инструментом считывания активации стволовых клеток.
Этот протокол подробно описывает создание органоидов, полученных из гипофиза мыши. С этой целью AL выделяют и диссоциируют на отдельные клетки, которые встроены во внеклеточный матрикс, имитирующий Matrigel (далее называемый ECM). Затем клеточно-ECM-сборку культивируют в определенной среде, по существу содержащей факторы роста стволовых клеток и гипофизарные эмбриональные регуляторы (далее называемые «гипофизарной органоидной средой» (PitOM)18; Таблица 1). Как только органоиды полностью развиты (через 10-14 дней), они могут быть дополнительно расширены путем последовательного прохождения и подвергнуты обширному последующему исследованию (например, иммунофлуоресценция, RT-qPCR и объемная или одноклеточная транскриптомика; Рисунок 1). В долгосрочной перспективе ожидается, что органоиды стволовых клеток гипофиза проложат путь к подходам к восстановлению тканей и регенеративной медицине.
Protocol
Representative Results
Discussion
Органоиды, полученные из AL, как описано здесь, представляют собой мощную исследовательскую модель для изучения стволовых клеток гипофиза in vitro. В настоящее время этот органоидный подход является единственным доступным инструментом для надежного и надежного выращивания и расшире…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Исследовательского фонда KU Leuven и Фонда научных исследований (FWO) – Фландрия. E.L. (11A3320N) и C.N. (1S14218N) поддерживаются докторской стипендией от FWO / FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
