Développement d’organoïdes de l’hypophyse de souris comme modèle in vitro pour explorer la biologie des cellules souches hypophysaires

L’hypophyse est une minuscule glande endocrine située à la base du cerveau, où elle est reliée à l’hypothalamus. La glande intègre des entrées périphériques et centrales (hypothalamiques) pour générer une libération hormonale réglée et coordonnée, régulant ainsi les organes endocriniens cibles en aval (tels que les glandes surrénales et les gonades) pour produire des hormones appropriées au bon moment. L’hypophyse est le régulateur clé du système endocrinien et est donc appelée à juste titre la glande maîtresse¹.

L’hypophyse de la souris se compose de trois lobes (Figure 1), c’est-à-dire le lobe antérieur (AL), le lobe intermédiaire (IL) et le lobe postérieur (PL). La principale AL endocrinienne contient cinq types de cellules hormonales, y compris les somatotropes qui produisent l’hormone de croissance (GH); lactotropes générant de la prolactine (PRL); corticotropes qui sécrètent l’hormone adrénocorticotrope (ACTH); thyrotropes responsables de la production d’hormone stimulant la thyroïde (TSH); et les gonadotrophes qui fabriquent l’hormone lutéinisante (LH) et l’hormone folliculo-stimulante (FSH). Le PL est constitué de projections axonales de l’hypothalamus dans lesquelles sont stockées les hormones ocytocine et vasopressine (hormone antidiurétique). L’IL est situé entre l’AL et le PL et abrite des mélanotropes qui produisent l’hormone stimulant les mélanocytes (MSH). Dans l’hypophyse humaine, l’IL régresse au cours du développement et les mélanotropes se propagent dans l’AL¹. En plus des cellules endocriniennes, l’hypophyse contient également un pool de cellules souches, essentiellement marquées par le facteur de transcription SOX2 2,3,4,5,6. Ces cellules SOX2⁺ sont situées dans la zone marginale (MZ), la paroi épithéliale de la fente (un reste de lumière embryonnaire entre l’AL et l’IL), ou sont réparties en grappes dans tout le parenchyme de l’AL, proposant ainsi deux niches de cellules souches dans la glande (Figure 1)2,3,4,5,6.

Compte tenu de la nature indispensable de l’hypophyse, un dysfonctionnement de la glande est associé à une morbidité grave. L’hyperpituitarisme (caractérisé par une sursécrétion d’une ou de plusieurs hormones) et l’hypopituitarisme (production défectueuse ou manquante d’une ou de plusieurs hormones) peuvent être causés par des tumeurs neuroendocrines hypophysaires (PitNET; par exemple, tumeurs productrices d’ACTH conduisant à la maladie de Cushing) ou par des défauts génétiques (par exemple, une carence en GH entraînant un nanisme)⁷. En outre, la chirurgie hypophysaire (par exemple, pour enlever des tumeurs), les infections (par exemple, la tuberculose hypothalamo-hypophysaire ou les infections consécutives à une méningite bactérienne ou à une encéphalite), le syndrome de Sheehan (nécrose due à un flux sanguin insuffisant dû à une perte de sang importante à la naissance), l’apoplexie hypophysaire et les lésions cérébrales traumatiques sont d’autres causes importantes d’hypofonction hypophysaire⁸ . Il a été démontré que l’hypophyse de la souris possède la capacité de régénération, étant capable de réparer les dommages locaux introduits par l’ablation transgénique des cellules endocriniennes ^9,10. Les cellules souches SOX2⁺ réagissent de manière aiguë à la lésion infligée en montrant un phénotype activé, marqué par une prolifération accrue (entraînant une expansion des cellules souches) et une expression accrue des facteurs et des voies liés à la souche (par exemple, WNT / NOTCH). De plus, les cellules souches commencent à exprimer l’hormone ablée, ce qui entraîne finalement une restauration substantielle de la population cellulaire épuisée au cours des mois suivants (5 à 6) ^9,10. En outre, pendant la phase de maturation néonatale de la glande (les 3 premières semaines après la naissance), les cellules souches hypophysaires prospèrent dans un état activé ^6,11,12,13, tandis que le vieillissement de l’organisme est associé à une diminution de la fonctionnalité des cellules souches in situ, en raison d’un (micro-) environnement inflammatoire croissant au vieillissement (ou « inflammatoire »)^10,14 . En outre, la tumorigenèse dans la glande est également associée à l’activation des cellules^{souches 7,15}. Bien que l’activation des cellules souches ait été détectée dans plusieurs situations de remodelage hypophysaire (examinées dans ^7,16), ^les mécanismes sous-jacents restent incertains. Étant donné que les approches in vivo (telles que le traçage de la lignée chez les souris transgéniques) n’ont pas fourni une image claire ou complète des cellules souches hypophysaires, le développement de modèles in vitro fiables pour explorer la biologie des cellules souches dans l’hypophyse normale et malade est essentiel. La culture in vitro standard de cellules souches hypophysaires primaires reste inadéquate en raison de la capacité de croissance très limitée et des conditions non physiologiques (2D) avec perte rapide du phénotype (pour un aperçu plus détaillé, voir¹⁶). Des cultures de sphères 3D (pituisphères) ont été établies à partir de cellules souches hypophysaires identifiées par la population latérale et le phénotype^{SOX2+ 2,3,4}. Les pituisphères se développent clonalement à partir des cellules souches, expriment des marqueurs de souche et montrent une capacité de différenciation dans les types de cellules endocriniennes. Cependant, ils ne s’étendent pas considérablement tout en ne montrant qu’une capacité de passage limitée (2-3 passages)^3,4. Des structures en forme de sphère ont également été obtenues à partir de grappes de cellules souches hypophysaires non dissociées lorsqu’elles ont été cultivées dans du Matrigel dilué à 50% pendant 1 semaine, mais l’extensibilité n’a pas été montrée¹⁷. L’approche de la pituisphère est principalement utilisée comme outil de lecture du nombre de cellules souches, mais d’autres applications sont limitées par une capacité d’expansion inférieure¹⁶.

Pour remédier et surmonter ces lacunes, un nouveau modèle 3D a récemment été mis en place, c’est-à-dire des organoïdes, à partir de l’AL endocrinien majeur de souris contenant la MZ et des cellules souches parenchymateuses. Il a été démontré que les organoïdes sont en effet dérivés des cellules souches de l’hypophyse et récapitulent fidèlement leur phénotype¹⁸. De plus, les organoïdes sont extensibles à long terme, tout en conservant solidement leur nature de tige. Par conséquent, ils fournissent une méthode fiable pour développer les cellules souches hypophysaires primaires pour une exploration profonde. Une telle exploration n’est pas réalisable avec le nombre limité de cellules souches qui peuvent être isolées d’une hypophyse, qui ne sont pas non plus extensibles dans des conditions 2D¹⁶. Il a été démontré que les organoïdes sont des outils précieux et fiables pour découvrir de nouvelles caractéristiques des cellules souches hypophysaires (traduisibles en in vivo)^14,18. Il est important de noter que le modèle organoïde reflète fidèlement le statut d’activation des cellules souches hypophysaires tel qu’il se produit lors de lésions tissulaires locales et de maturation néonatale, montrant une efficacité de formation améliorée et reproduisant des voies moléculaires régulées à la hausse^14,18. Par conséquent, le modèle organoïde dérivé de l’hypophyse est un modèle de recherche innovant et puissant sur la biologie des cellules souches hypophysaires ainsi qu’un outil de lecture de l’activation des cellules souches.

Ce protocole décrit en détail l’établissement d’organoïdes dérivés de l’hypophyse de souris. À cette fin, l’AL est isolée et dissociée en cellules uniques, qui sont incorporées dans matrigel imitant la matrice extracellulaire (ci-après dénommé ECM). L’assemblage cellule-ECM est ensuite cultivé dans un milieu défini, contenant essentiellement des facteurs de croissance des cellules souches et des régulateurs embryonnaires hypophysaires (ci-après dénommés « milieu organoïde hypophysaire » (PitOM)¹⁸; Tableau 1). Une fois que les organoïdes sont complètement développés (après 10 à 14 jours), ils peuvent être élargis par un passage séquentiel et soumis à une exploration approfondie en aval (par exemple, immunofluorescence, RT-qPCR et transcriptomique en vrac ou unicellulaire; Figure 1). À plus long terme, on s’attend à ce que les organoïdes de cellules souches hypophysaires ouvrent la voie à des approches de réparation des tissus et à la médecine régénérative.