Desenvolvimento de organoides da Pituitária do Rato como Modelo In Vitro para Explorar a Biologia das Células-Tronco Pituitárias

A pituitária é uma pequena glândula endócrina localizada na base do cérebro, onde está conectada ao hipotálamo. A glândula integra insumos periféricos e centrais (hipotalâmicos) para gerar uma liberação hormonal afinada e coordenada, regulando assim órgãos endócrinos de alvo a jusante (como glândulas suprarrenais e gônados) para produzir hormônios apropriados no momento adequado. A pituitária é o principal regulador do sistema endócrino e, portanto, é legitimamente denominada a glândula mestre¹.

A pituitária do rato é composta por três lóbulos (Figura 1), ou seja, o lobo anterior (AL), o lobo intermediário (IL) e o lobo posterior (PL). A al endócrina principal contém cinco tipos de células hormonais, incluindo somatotropes que produzem hormônio do crescimento (GH); lactotropas gerando prolactina (PRL); corticotrópicas que secretam hormônio adrenocorticotrópico (ACTH); thyrotropes responsáveis pela produção de hormônio estimulante da tireoide (TSH); e gonadotropes que fazem hormônio luteinizador (LH) e hormônio estimulante do folículo (FSH). O PL consiste em projeções axonais do hipotálamo em que os hormônios ocitocina e vasopressina (hormônio antidiurético) são armazenados. O IL está localizado entre a AL e o PL e abriga melanantropos que produzem hormônio estimulante de melanócitos (MSH). Na pituitária humana, o IL regrede durante o desenvolvimento, e os melanotropos são espalhados dentro da AL¹. Além das células endócrinas, a glândula pituitária também contém um conjunto de células-tronco, essencialmente marcadas pelo fator de transcrição SOX2 2,3,4,5,6. Estas células SOX2⁺ estão localizadas na zona marginal (MZ), o revestimento epitelial da fissura (um lúmen remanescente embrionário entre a AL e a IL), ou são espalhadas como aglomerados por todo o parenchyma da AL, propondo assim dois nichos de células-tronco na glândula (Figura 1)2,3,4,5,6.

Dada a natureza indispensável da hipófise, o mau funcionamento da glândula está associado à morbidade grave. O hiperpituitarismo (caracterizado pela supernecreção de um ou mais hormônios) e hipopituitarismo (produção defeituosa ou ausente de um ou mais hormônios) podem ser causados por tumores neuroendócrinos pituitários (PitNETs; por exemplo, tumores produtores de ACTH que levam à doença de Cushing) ou por defeitos genéticos (por exemplo, deficiência de GH resultando em nanô)⁷. Além disso, cirurgia pituitária (por exemplo, para remover tumores), infecções (por exemplo, tuberculose hipotalâmica-pituitária, ou infecções após meningite bacteriana ou encefalite), síndrome de Sheehan (necrose devido ao fluxo sanguíneo insuficiente devido à forte perda de sangue ao nascer), apoplexia pituitária e lesão cerebral traumática são outras causas importantes de hipofunção pituitária⁸ . Foi demonstrado que a pituitária do camundongo possui a capacidade regenerativa, sendo capaz de reparar danos locais introduzidos pela ablação transgênica das células endócrinas ^9,10. As células-tronco SOX2⁺ reagem agudamente à lesão infligida mostrando um fenótipo ativado, marcado por maior proliferação (resultando em expansão de células-tronco) e aumento da expressão de fatores e caminhos relacionados à haste (por exemplo, WNT/NOTCH). Além disso, as células-tronco começam a expressar o hormônio ablado, resultando finalmente na restauração substancial da população celular empobrecida ao longo dos seguintes (5 a 6) meses ^9,10. Além disso, durante a fase de maturação neonatal da glândula (as primeiras 3 semanas após o nascimento), as células-tronco pituitárias estão prosperando em um estado ativado ^6,11,12,13, enquanto o envelhecimento organismo está associado à diminuição da funcionalidade de células-tronco in situ, devido a um ambiente inflamatório crescente (micro-) ao envelhecimento (ou ‘inflamação’)^10,14 . Além disso, a tumorigênese na glândula também está associada à ativação^de células-tronco ^7,15. Embora a ativação de células-tronco tenha sido detectada em várias situações de remodelação pituitária (revisada em ^7,16), os mecanismos subjacentes permanecem incertos. Uma vez que as abordagens in vivo (como o rastreamento de linhagem em camundongos transgênicos) não forneceram uma imagem clara ou abrangente de células-tronco pituitárias, o desenvolvimento de modelos in vitro confiáveis para explorar a biologia de células-tronco em hipófise normal e doente é essencial. A cultura in vitro padrão de células-tronco primárias pituitárias permanece inadequada devido à capacidade de crescimento muito limitada e condições não fisiológicas (2D) com perda rápida de fenótipo (para uma visão geral mais detalhada, veja¹⁶). Culturas de esfera 3D (pituosferas) foram estabelecidas a partir de células-tronco pituitárias identificadas pela população lateral e fenótipo SOX2^{+ 2,3,4}. As pituferas crescem clonalmente a partir das células-tronco, expressam marcadores de tronco e mostram capacidade de diferenciação nos tipos de células endócrinas. No entanto, eles não se expandem consideravelmente, mostrando apenas passabilidade limitada (2-3 passagens)^3,4. Estruturas semelhantes a esferas também foram obtidas de aglomerados de células-tronco pituitárias não dissociados quando cultivadas em Matrigel 50% diluído por 1 semana, mas a expansão não foi mostrada¹⁷. A abordagem pituisphere é usada principalmente como uma ferramenta de leitura para números de células-tronco, mas outras aplicações são limitadas por capacidade de expansão inferior¹⁶.

Para resolver e superar essas deficiências, um novo modelo 3D foi recentemente estabelecido, ou seja, organoides, a partir da maior AL endócrina de camundongos contendo as células-tronco MZ e parenchymal. Foi demonstrado que os organoides são de fato derivados das células-tronco da hipófise e recapitulam fielmente seu fenótipo¹⁸. Além disso, os organoides são expansíveis a longo prazo, mantendo robustamente sua natureza de caule. Portanto, eles fornecem um método confiável para expandir células-tronco primárias pituitárias para exploração profunda. Tal exploração não é alcançável com o número limitado de células-tronco que podem ser isoladas de uma pituitária, que também não são expansíveis em condições 2D¹⁶. Foi demonstrado que os organoides são ferramentas valiosas e confiáveis para descobrir novas características de células-tronco pituitárias (traduzíveis para in vivo)^14,18. É importante ressaltar que o modelo organoide espelha fielmente o estado de ativação de células-tronco pituitárias como ocorrendo durante danos teciduais locais e maturação neonatal, mostrando maior eficiência de formação e replicando vias moleculares regulamentadas^14,18. Assim, o modelo organoide derivado da hipófise é um inovador e poderoso modelo de pesquisa de biologia de células-tronco pituitárias, bem como uma ferramenta de leitura de ativação de células-tronco.

Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento de organoides derivados da pituitária do rato. Para este objetivo, a AL é isolada e dissociada em células únicas, que são incorporadas em matrigel extracelular (aquion referido como ECM). O conjunto célula-ECM é então cultivado em um meio definido, essencialmente contendo fatores de crescimento de células-tronco e reguladores embrionários pituitários (ainda mais chamados de “meio organoide pituitário” (PitOM)¹⁸; Tabela 1). Uma vez que os organoides são totalmente desenvolvidos (após 10-14 dias), eles podem ser ainda mais expandidos através de passagem sequencial e submetidos a extensa exploração a jusante (por exemplo, imunofluorescência, RT-qPCR e transcrição em massa ou unicelular; Figura 1). A longo prazo, espera-se que os organoides de células-tronco pituitárias abram caminho para abordagens de reparação tecidual e medicina regenerativa.