تطوير المواد العضوية من الغدة النخامية الفأر كما في المختبر نموذج لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية
Summary
الغدة النخامية هي المنظم الرئيسي لنظام الغدد الصماء في الجسم. تصف هذه المقالة تطور المواد العضوية من الغدة النخامية للفأر كنموذج 3D جديد في المختبر لدراسة مجموعة الخلايا الجذعية في الغدة التي لا تزال البيولوجيا والوظيفة غير مفهومة بشكل جيد.
Abstract
الغدة النخامية هي الغدة الصماء الرئيسية التي تنظم العمليات الفسيولوجية الرئيسية ، بما في ذلك نمو الجسم ، والتمثيل الغذائي ، والنضج الجنسي ، والتكاثر ، والاستجابة للإجهاد. منذ أكثر من عقد من الزمان ، تم تحديد الخلايا الجذعية في الغدة النخامية. ومع ذلك ، على الرغم من تطبيق مناهج المعدلة وراثيا في الجسم الحي ، إلا أن نمطها الظاهري والبيولوجيا ودورها لا يزال غير واضح. لمعالجة هذا اللغز ، تم تطوير نموذج عضوي جديد ومبتكر في المختبر لكشف بيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية بعمق. تمثل المواد العضوية هياكل الخلايا 3D التي ، في ظل ظروف ثقافة محددة ، تتطور ذاتيا من الخلايا الجذعية (الظهارية) للأنسجة وتلخص علامات مميزة متعددة لتلك الخلايا الجذعية وأنسجتها. يظهر هنا أن المواد العضوية المشتقة من الغدة النخامية للفئران تتطور من الخلايا الجذعية للغدة وتلخص بأمانة خصائصها الظاهرية والوظيفية في الجسم الحي . من بين أمور أخرى ، فإنها تعيد إنتاج حالة تنشيط الخلايا الجذعية كما هو الحال في الجسم الحي التي تحدث استجابة للضرر الموضعي المعدل وراثيا. المواد العضوية قابلة للتوسع على المدى الطويل مع الاحتفاظ بقوة بنمطها الظاهري الجذعي. ويعد النموذج البحثي الجديد ذا قيمة عالية لفك رموز النمط الظاهري للخلايا الجذعية وسلوكها خلال الظروف الرئيسية لإعادة تشكيل الغدة النخامية، بدءا من نضج حديثي الولادة إلى التلاشي المرتبط بالشيخوخة، ومن الغدد الصحية إلى الغدد المريضة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإنشاء المواد العضوية المشتقة من الغدة النخامية للفئران ، والتي توفر أداة قوية للغوص في عالم الخلايا الجذعية النخامية الغامض.
Introduction
الغدة النخامية هي غدة صماء صغيرة تقع في قاعدة الدماغ ، حيث ترتبط بمنطقة ما تحت المهاد. تدمج الغدة المدخلات الطرفية والمركزية (تحت المهاد) لتوليد إطلاق هرمون مضبوط ومنسق ، وبالتالي تنظيم أعضاء الغدد الصماء المستهدفة في المصب (مثل الغدد الكظرية والغدد التناسلية) لإنتاج الهرمونات المناسبة في الوقت المناسب. الغدة النخامية هي المنظم الرئيسي لنظام الغدد الصماء ، وبالتالي يطلق عليها بحق الغدة الرئيسية1.
تتكون الغدة النخامية للفأر من ثلاثة فصوص (الشكل 1) ، أي الفص الأمامي (AL) ، والفص الوسيط (IL) ، والفص الخلفي (PL). الغدد الصماء الرئيسية AL يحتوي على خمسة أنواع من الخلايا الهرمونية, بما في ذلك somatotropes التي تنتج هرمون النمو (GH); اللاكتوتروبات التي تولد البرولاكتين (PRL) ؛ القشرية التي تفرز هرمون قشر الكظر (ACTH) ؛ الثيروتروب المسؤول عن إنتاج هرمون تحفيز الغدة الدرقية (TSH) ؛ والغدد التناسلية التي تصنع الهرمون الملوتن (LH) والهرمون المنبه للجريب (FSH). يتكون PL من إسقاطات محورية من منطقة ما تحت المهاد حيث يتم تخزين هرمونات الأوكسيتوسين وفاسوبريسين (هرمون مضاد لإدرار البول). يقع IL بين AL و PL ويضم الميلانوتروب التي تنتج هرمون تحفيز الخلايا الصباغية (MSH). في الغدة النخامية البشرية ، يتراجع IL أثناء التطور ، وتنتشر الميلانوتروب داخل AL1. بالإضافة إلى خلايا الغدد الصماء ، تحتوي الغدة النخامية أيضا على مجموعة من الخلايا الجذعية ، تتميز بشكل أساسي بعامل النسخ SOX2 2,3,4,5,6. تقع خلايا SOX2+ هذه في المنطقة الهامشية (MZ) ، البطانة الظهارية للشق (تجويف بقايا جنينية بين AL و IL) ، أو تنتشر كمجموعات في جميع أنحاء حمة AL ، مما يقترح اثنين من منافذ الخلايا الجذعية في الغدة (الشكل 1) 2،3،4،5،6.
بالنظر إلى الطبيعة التي لا غنى عنها للغدة النخامية ، يرتبط خلل في الغدة بأمراض خطيرة. يمكن أن يحدث فرط الغدة النخامية (الذي يتميز بالإفراط في إفراز واحد أو أكثر من الهرمونات) وقصور الغدة النخامية (إنتاج معيب أو مفقود لواحد أو أكثر من الهرمونات) بسبب أورام الغدد الصماء العصبية النخامية (PitNETs ؛ على سبيل المثال ، الأورام المنتجة ل ACTH التي تؤدي إلى مرض كوشينغ) أو بسبب العيوب الوراثية (على سبيل المثال ، نقص هرمون النمو مما يؤدي إلى التقزم)7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جراحة الغدة النخامية (على سبيل المثال ، لإزالة الأورام) ، والالتهابات (على سبيل المثال ، السل تحت المهاد والغدة النخامية ، أو العدوى التي تلي التهاب السحايا الجرثومي أو التهاب الدماغ) ، ومتلازمة شيهان (نخر بسبب عدم كفاية تدفق الدم بسبب فقدان الدم الشديد عند الولادة) ، وسكتة الغدة النخامية وإصابة الدماغ الرضحية هي أسباب مهمة أخرى لنقص وظائف الغدة النخامية8 . وقد تبين أن الغدة النخامية للفأر تمتلك القدرة التجديدية ، حيث تكون قادرة على إصلاح الضرر المحلي الناجم عن الاستئصال المعدل وراثيا لخلايا الغدد الصماء 9,10. تتفاعل الخلايا الجذعية SOX2+ بشكل حاد مع الإصابة التي تظهر نمطا ظاهريا نشطا ، يتميز بانتشار معزز (مما يؤدي إلى توسع الخلايا الجذعية) وزيادة التعبير عن العوامل والمسارات المرتبطة بالجذعية (على سبيل المثال ، WNT / NOTCH). علاوة على ذلك ، تبدأ الخلايا الجذعية في التعبير عن الهرمون المبتور ، مما يؤدي في النهاية إلى استعادة كبيرة لمجموعة الخلايا المستنفدة على مدى الأشهر التالية (5 إلى 6) 9,10. أيضا ، خلال مرحلة نضج حديثي الولادة للغدة (أول 3 أسابيع بعد الولادة) ، تزدهر الخلايا الجذعية النخامية في حالة تنشيط 6,11,12,13 ، في حين ترتبط الشيخوخة العضوية بانخفاض وظائف الخلايا الجذعية في الموقع ، بسبب زيادة البيئة الالتهابية (الدقيقة) عند الشيخوخة (أو “الالتهاب”)10,14 . بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط تكوين الورم في الغدة أيضا بتنشيط الخلايا الجذعية 7,15. على الرغم من اكتشاف تنشيط الخلايا الجذعية في العديد من حالات إعادة تشكيل الغدة النخامية (تمت مراجعتها في 7,16) ، إلا أن الآليات الأساسية لا تزال غير واضحة. نظرا لأن النهج في الجسم الحي (مثل تتبع النسب في الفئران المعدلة وراثيا) لم تقدم صورة واضحة أو شاملة للخلايا الجذعية للنخامة ، فإن تطوير نماذج موثوقة في المختبر لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية في الغدة النخامية الطبيعية والمريضة أمر ضروري. لا تزال الزراعة القياسية في المختبر للخلايا الجذعية الأولية للنخامة غير كافية بسبب قدرة النمو المحدودة للغاية والظروف غير الفسيولوجية (2D) مع الفقدان السريع للنمط الظاهري (للحصول على نظرة عامة أكثر تفصيلا ، انظر16). تم إنشاء مزارع المجال ثلاثي الأبعاد (pituispheres) من الخلايا الجذعية النخامية كما تم تحديدها من قبل السكان الجانبيين والنمط الظاهري SOX2 + 2,3,4. تنمو البيتيسفير بشكل مستنسخ من الخلايا الجذعية ، وتعبر عن علامات الجذعية وتظهر قدرة التمايز في أنواع خلايا الغدد الصماء. ومع ذلك ، فإنها لا تتوسع بشكل كبير بينما تظهر فقط قابلية مرور محدودة (2-3 مقاطع) 3,4. كما تم الحصول على هياكل تشبه الكرة من مجموعات الخلايا الجذعية النخامية غير المنفصلة عند استزراعها في 50٪ من Matrigel المخفف لمدة أسبوع واحد ، ولكن لم تظهر قابلية التوسع17. يستخدم نهج البيتوسفير في الغالب كأداة قراءة لأعداد الخلايا الجذعية ، ولكن التطبيقات الأخرى محدودة بقدرة توسع أقل شأنا16.
لمعالجة هذه العيوب والتغلب عليها ، تم مؤخرا إنشاء نموذج 3D جديد ، أي المواد العضوية ، بدءا من AL الغدد الصماء الرئيسية للفئران التي تحتوي على MZ والخلايا الجذعية المتني. وقد تبين أن المواد العضوية مشتقة بالفعل من الخلايا الجذعية للغدة النخامية وتلخص بأمانة نمطها الظاهري18. علاوة على ذلك ، فإن المواد العضوية قابلة للتوسع على المدى الطويل ، مع الحفاظ بقوة على طبيعتها الجذعية. لذلك ، فإنها توفر طريقة موثوقة لتوسيع الخلايا الجذعية الأولية للنخامة للاستكشاف العميق. مثل هذا الاستكشاف غير قابل للتحقيق مع العدد المحدود من الخلايا الجذعية التي يمكن عزلها من الغدة النخامية ، والتي هي أيضا غير قابلة للتوسيع في ظروف ثنائية الأبعاد16. وقد تبين أن المواد العضوية هي أدوات قيمة وموثوقة للكشف عن ميزات الخلايا الجذعية النخامية الجديدة (يمكن ترجمتها إلى الجسم الحي)14،18. الأهم من ذلك ، أن النموذج العضوي يعكس بأمانة حالة تنشيط الخلايا الجذعية النخامية كما يحدث أثناء تلف الأنسجة المحلية ونضج حديثي الولادة ، مما يدل على تعزيز كفاءة التكوين وتكرار المسارات الجزيئية غير المنظمة14،18. وبالتالي ، فإن نموذج العضوية المشتق من الغدة النخامية هو نموذج بحثي مبتكر وقوي لبيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية بالإضافة إلى أداة قراءة تنشيط الخلايا الجذعية.
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل إنشاء المواد العضوية المشتقة من الغدة النخامية للفئران. تحقيقا لهذا الهدف ، يتم عزل AL وفصله إلى خلايا مفردة ، والتي يتم تضمينها في مصفوفة محاكاة خارج الخلية Matrigel (يشار إليها هنا باسم ECM). ثم يتم استزراع مجموعة الخلايا ECM في وسط محدد ، يحتوي بشكل أساسي على عوامل نمو الخلايا الجذعية ومنظمات الغدة النخامية الجنينية (يشار إليها أيضا باسم “وسط الغدة النخامية” العضوي (PitOM)18 ؛ الجدول 1). بمجرد اكتمال تطوير المواد العضوية (بعد 10-14 يوما) ، يمكن توسيعها بشكل أكبر من خلال المرور المتسلسل للحوض الصغير وإخضاعها لاستكشاف مكثف في اتجاه المصب (على سبيل المثال ، التألق المناعي ، RT-qPCR ، والنسخ السائبة أو أحادية الخلية ؛ الشكل 1). على المدى الطويل ، من المتوقع أن تمهد الخلايا الجذعية النخامية العضوية الطريق لنهج إصلاح الأنسجة والطب التجديدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمثل المواد العضوية المشتقة من AL ، كما هو موضح هنا ، نموذجا بحثيا قويا لدراسة الخلايا الجذعية النخامية في المختبر. في الوقت الحاضر ، هذا النهج العضوي هو الأداة الوحيدة المتاحة لنمو وتوسيع الخلايا الجذعية الأولية للنخامة بشكل موثوق وقوي. وقد أبلغ سابقا عن نموذج عضوي للغدة النخامية مش?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من صندوق أبحاث KU Leuven وصندوق البحث العلمي (FWO) – فلاندرز. يتم دعم E.L. (11A3320N) ، و C.N. (1S14218N) من خلال زمالة الدكتوراه من FWO / FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
