Sviluppo di organoidi dall'ipofisi di topo come modello in vitro per esplorare la biologia delle cellule staminali ipofisarie

L’ipofisi è una piccola ghiandola endocrina situata alla base del cervello, dove è collegata all’ipotalamo. La ghiandola integra input periferici e centrali (ipotalamici) per generare un rilascio ormonale sintonizzato e coordinato, regolando così gli organi endocrini bersaglio a valle (come ghiandole surrenali e gonadi) per produrre ormoni appropriati al momento giusto. L’ipofisi è il regolatore chiave del sistema endocrino ed è quindi giustamente definita la ghiandola principale¹.

L’ipofisi del topo è costituita da tre lobi (Figura 1), cioè il lobo anteriore (AL), il lobo intermedio (IL) e il lobo posteriore (PL). Il principale AL endocrino contiene cinque tipi di cellule ormonali, compresi i somatotropi che producono l’ormone della crescita (GH); lattotropi che generano prolattina (PRL); corticotropi che secernono ormone adrenocorticotropo (ACTH); tireotropi responsabili della produzione di ormone stimolante la tiroide (TSH); e gonadotropi che producono l’ormone luteinizzante (LH) e l’ormone follicolo-stimolante (FSH). Il PL consiste in proiezioni assonali dall’ipotalamo in cui sono immagazzinati gli ormoni ossitocina e vasopressina (ormone antidiuretico). L’IL si trova tra l’AL e il PL e ospita melanotropi che producono l’ormone stimolante i melanociti (MSH). Nell’ipofisi umana, l’IL regredisce durante lo sviluppo e i melanotropi si diffondono all’interno dell’AL¹. Oltre alle cellule endocrine, la ghiandola pituitaria contiene anche un pool di cellule staminali, essenzialmente contrassegnate dal fattore di trascrizione SOX2 2,3,4,5,6. Queste cellule SOX2⁺ si trovano nella zona marginale (MZ), il rivestimento epiteliale della fessura (un lume residuo embrionale tra AL e IL), o sono diffuse come cluster in tutto il parenchima dell’AL, proponendo così due nicchie di cellule staminali nella ghiandola (Figura 1)2,3,4,5,6.

Data la natura indispensabile dell’ipofisi, il malfunzionamento della ghiandola è associato a una grave morbilità. L’iperpituitarismo (caratterizzato da eccessiva secrezione di uno o più ormoni) e l’ipopituitarismo (produzione difettosa o mancante di uno o più ormoni) possono essere causati da tumori neuroendocrini ipofisari (PitNET; ad esempio, tumori che producono ACTH che portano alla malattia di Cushing) o da difetti genetici (ad esempio, deficit di GH con conseguente nanismo)⁷. Inoltre, la chirurgia ipofisaria (ad esempio, per rimuovere i tumori), le infezioni (ad esempio, la tubercolosi ipotalamo-ipofisaria o le infezioni a seguito di meningite batterica o encefalite), la sindrome di Sheehan (necrosi a causa di un flusso sanguigno insufficiente a causa della forte perdita di sangue alla nascita), l’apoplessia ipofisaria e la lesione cerebrale traumatica sono altre importanti cause di ipofunzione ipofisaria⁸ . È stato dimostrato che l’ipofisi del topo possiede la capacità rigenerativa, essendo in grado di riparare il danno locale introdotto dall’ablazione transgenica delle cellule endocrine ^9,10. Le cellule staminali SOX2⁺ reagiscono acutamente alla lesione inflitta mostrando un fenotipo attivato, caratterizzato da una maggiore proliferazione (con conseguente espansione delle cellule staminali) e da una maggiore espressione di fattori e percorsi correlati alla staminalità (ad esempio, WNT / NOTCH). Inoltre, le cellule staminali iniziano ad esprimere l’ormone ablato, con conseguente ripristino sostanziale della popolazione cellulare impoverita nei successivi (da 5 a 6) mesi ^9,10. Inoltre, durante la fase di maturazione neonatale della ghiandola (le prime 3 settimane dopo la nascita), le cellule staminali ipofisarie prosperano in uno stato attivato 6,11,12,13, mentre l’invecchiamento dell’organismo è associato a una ridotta funzionalità delle cellule staminali in situ, a causa di un crescente ambiente infiammatorio (micro-) all’invecchiamento (o ‘inflammaging’)^10,14 . Inoltre, la tumorigenesi nella ghiandola è anche associata all’attivazione delle cellule staminali ^7,15. Sebbene l’attivazione delle cellule staminali sia stata rilevata in diverse situazioni di rimodellamento ipofisario (esaminata in ^7,16), i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Poiché gli approcci in vivo (come il tracciamento del lignaggio nei topi transgenici) non hanno fornito un quadro chiaro o completo delle cellule staminali ipofisarie, lo sviluppo di modelli in vitro affidabili per esplorare la biologia delle cellule staminali nell’ipofisi normale e malata è essenziale. La coltura standard in vitro di cellule staminali ipofisarie primarie rimane inadeguata a causa della capacità di crescita molto limitata e delle condizioni non fisiologiche (2D) con rapida perdita di fenotipo (per una panoramica più dettagliata, vedere¹⁶). Colture di sfere 3D (pituisfere) sono state stabilite da cellule staminali ipofisarie identificate dalla popolazione laterale e dal fenotipo^{SOX2+ 2,3,4}. Le pituisfere crescono clonalmente dalle cellule staminali, esprimono marcatori di staminalità e mostrano capacità di differenziazione nei tipi di cellule endocrine. Tuttavia, non si espandono considerevolmente mentre mostrano solo una limitata passabilità (2-3 passaggi)^3,4. Strutture simili a sfere sono state ottenute anche da cluster di cellule staminali ipofisarie non dissociate quando coltivate in Matrigel diluito al 50% per 1 settimana, ma l’espandibilità non è stata mostrata¹⁷. L’approccio della pituisfera è utilizzato principalmente come strumento di lettura per il numero di cellule staminali, ma ulteriori applicazioni sono limitate da una capacità di espansione inferiore¹⁶.

Per affrontare e superare queste carenze, è stato recentemente stabilito un nuovo modello 3D, ovvero gli organoidi, a partire dal principale AL endocrino dei topi contenenti MZ e cellule staminali parenchimali. È stato dimostrato che gli organoidi sono effettivamente derivati dalle cellule staminali dell’ipofisi e ricapitolano fedelmente il loro fenotipo¹⁸. Inoltre, gli organoidi sono espandibili a lungo termine, pur mantenendo robustamente la loro natura di stelo. Pertanto, forniscono un metodo affidabile per espandere le cellule staminali ipofisarie primarie per un’esplorazione profonda. Tale esplorazione non è realizzabile con il numero limitato di cellule staminali che possono essere isolate da un’ipofisi, che non sono espandibili in condizioni 2D¹⁶. È stato dimostrato che gli organoidi sono strumenti preziosi e affidabili per scoprire nuove caratteristiche delle cellule staminali ipofisarie (traducibili in vivo)^14,18. È importante sottolineare che il modello organoide rispecchia fedelmente lo stato di attivazione delle cellule staminali ipofisarie che si verifica durante il danno tissutale locale e la maturazione neonatale, mostrando una maggiore efficienza di formazione e replicando percorsi molecolari sovraregolati^14,18. Quindi, il modello organoide derivato dall’ipofisi è un modello di ricerca innovativo e potente sulla biologia delle cellule staminali ipofisarie, nonché uno strumento di lettura dell’attivazione delle cellule staminali.

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di organoidi derivati dall’ipofisi di topo. A tal fine, l’AL è isolato e dissociato in singole cellule, che sono incorporate in Matrigel che imita la matrice extracellulare (di seguito denominata ECM). L’assemblaggio cellulare-ECM viene quindi coltivato in un mezzo definito, contenente essenzialmente fattori di crescita delle cellule staminali e regolatori embrionali ipofisari (ulteriormente denominato “mezzo organoide ipofisario” (PitOM)¹⁸; Tabella 1). Una volta che gli organoidi sono completamente sviluppati (dopo 10-14 giorni), possono essere ulteriormente espansi attraverso il passaggio sequenziale e sottoposti a un’ampia esplorazione a valle (ad esempio, immunofluorescenza, RT-qPCR e trascrittomica di massa o monocellulare; Figura 1). A lungo termine, si prevede che gli organoidi delle cellule staminali ipofisarie apriranno la strada agli approcci di riparazione dei tessuti e alla medicina rigenerativa.