פיתוח של Organoids מן בלוטת יותרת המוח עכבר כמו מודל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח
Summary
בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית של הגוף. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של organoids מן בלוטת יותרת המוח העכבר כמו מודל הפריה חוץ גופית 3D רומן לחקור את אוכלוסיית תאי הגזע של הבלוטה אשר הביולוגיה והתפקוד נשארים מובנים היטב.
Abstract
בלוטת יותרת המוח היא בלוטת האנדוקרינית הראשית ויסות תהליכים פיזיולוגיים מפתח, כולל צמיחת הגוף, חילוף החומרים, התבגרות מינית, רבייה, ותגובת מתח. לפני יותר מעשור, תאי גזע זוהו בבלוטת יותרת המוח. עם זאת, למרות היישום של גישות vivogenic, פנוטיפ שלהם, ביולוגיה, ותפקיד עדיין לא ברור. כדי להתמודד עם תעלומה זו, מודל חדש וחדשני אורגנויד במבחנה מפותחת כדי לפענח עמוק ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח. אורגנוידים מייצגים מבני תאים תלת-ממדיים, אשר בתנאי תרבית מוגדרים, מתפתחים באופן עצמי מתאי גזע (אפיתל) של רקמה ומסמנים מחדש סימני היכר מרובים של תאי גזע אלה ורקמתם. זה מוצג כאן כי אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח מפתחים מתאי הגזע של הבלוטה, בנאמנות recapitulate שלהם in vivo phenotypic ומאפיינים פונקציונליים. בין היתר, הם משחזרים את מצב ההפעלה של תאי הגזע כמו ויוו המתרחשים בתגובה לנזק מקומי שנגרם מהונדסים. האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך תוך שמירה איתנה על פנוטיפ הגבעול שלהם. מודל המחקר החדש הוא בעל ערך רב כדי לפענח את הפנוטיפ של תאי הגזע והתנהגות במהלך תנאים מרכזיים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח, החל התבגרות יילודים כדי דהייה הקשורים להזדקנות, ומ בריא לבלוטות חולים. כאן, פרוטוקול מפורט מוצג כדי להקים אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח עכבר, אשר מספקים כלי רב עוצמה לצלול לתוך העולם עדיין חידתי של תאי גזע בלוטת יותרת המוח.
Introduction
בלוטת יותרת המוח היא בלוטה אנדוקרינית זעירה הממוקמת בבסיס המוח, שם היא מחוברת להיפותלמוס. הבלוטה משלבת תשומות היקפיות ומרכזיות (היפותלמיות) כדי ליצור שחרור הורמונלי מכוון ומתואם, ובכך מווסתת איברים אנדוקריניים למטרה במורד הזרם (כגון בלוטות יותרת הכליה ובלוטות המין) לייצור הורמונים מתאימים בזמן הנכון. בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית ולכן הוא מכונה בצדק בלוטת הורים1.
בלוטת יותרת המוח של העכבר מורכבת משלוש אונות (איור 1), כלומר, האונה הקדמית (AL), האונה האמצעית (IL) והאונה האחורית (PL). AL האנדוקרינית העיקרית מכילה חמישה סוגי תאים הורמונליים, כולל סומטוטרופים המייצרים הורמון גדילה (GH); לקטוטרופים המייצרים פרולקטין (PRL); קורטיקוטרופים המפרישים הורמון adrenocorticotropic (ACTH); תירוטרופים האחראים על ייצור הורמון מגרה בלוטת התריס (TSH); וגונדוטרופים שהופכים הורמון מחלמן (LH) והורמון מגרה זקיק (FSH). PL מורכב תחזיות אקסונליות מן ההיפותלמוס שבו ההורמונים אוקסיטוצין ו vasopressin (הורמון antidiuretic) מאוחסנים. ה- IL ממוקם בין AL ו- PL ובתים מלנוטרופים המייצרים הורמון מגרה מלנוציטים (MSH). בבלוטת יותרת המוח האנושית, IL נסוג במהלך הפיתוח, מלנוטרופים מופצים בתוך AL1. בנוסף לתאים האנדוקריניים, בלוטת יותרת המוח מכיל גם בריכה של תאי גזע, מסומן בעצם על ידי גורם שעתוק SOX2 2,3,4,5,6. תאי SOX2+ אלה ממוקמים באזור השולי (MZ), בטנת האפיתל של השסע (לומן שריד עוברי בין AL ל- IL), או מפוזרים כאשכולות לאורך הפרנצ’ימה של AL, ובכך מציעים שתי נישות תאי גזע בבלוטה (איור 1)2,3,4,5,6.
בהתחשב באופי החיוני של בלוטת יותרת המוח, תקלה של הבלוטה קשורה עם תחלואה חמורה. Hyperpituitarism (מאופיין על ידי הפרשת יתר של הורמון אחד או יותר) ו hypopituitarism (ייצור פגום או חסר של הורמון אחד או יותר) יכול להיגרם על ידי גידולים נוירואנדוקריניים יותרת המוח (PitNETs; למשל, גידולים המייצרים ACTH המובילים למחלת קושינג) או על ידי פגמים גנטיים (למשל, חוסר GH וכתוצאה מכך גמדות)7. בנוסף, ניתוח בלוטת יותרת המוח (למשל, כדי להסיר גידולים), זיהומים (למשל, שחפת ההיפותלמוסית-יותרת המוח, או זיהומים בעקבות דלקת קרום המוח חיידקית או דלקת המוח), תסמונת שיאן (נמק בגלל זרימת דם לא מספקת עקב איבוד דם כבד בלידה- מתן), אפופלקסיה בלוטת יותרת המוח ופגיעה מוחית טראומטית הם גורמים חשובים אחרים של hypofunction בלוטת יותרת המוח8 . הוכח כי בלוטת יותרת המוח העכבר בעל יכולת התחדשות, להיות מסוגל לתקן נזק מקומי הציג על ידי אבלציה מהונדסת של תאים אנדוקריניים 9,10. תאי הגזע SOX2+ מגיבים בחריפות לפציעה שנגרמה מראה פנוטיפ פעיל, מסומן על ידי התפשטות משופרת (וכתוצאה מכך התרחבות תאי גזע) וביטוי מוגבר של גורמים ומסלולים הקשורים לגבעול (למשל, WNT / NOTCH). יתר על כן, תאי הגזע מתחילים לבטא את ההורמון ablated, ולבסוף וכתוצאה מכך שיקום משמעותי של אוכלוסיית התאים המדולדלים במהלך החודשים הבאים (5 עד 6) 9,10. כמו כן, במהלך שלב ההתבגרות היילוד של הבלוטה (3 השבועות הראשונים לאחר הלידה), תאי הגזע של בלוטת יותרת המוח משגשגים במצב פעיל 6,11,12,13, ואילו הזדקנות אורגניזמית קשורה לירידה בתפקוד תאי הגזע במקום, עקב סביבה דלקתית גוברת (מיקרו)בהזדקנות (או ‘הדלקה’)10,14 . בנוסף, tumorigenesis בבלוטה קשורה גם עם הפעלת תאי גזע 7,15. למרות הפעלת תאי גזע זוהתה במספר מצבים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח (נסקר ב 7,16), המנגנונים הבסיסיים עדיין לא ברורים. מאז in vivo גישות (כגון מעקב שושלת בעכברים מהונדסים) לא סיפקו תמונה ברורה או מקיפה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח, פיתוח של מודלים במבחנה אמין לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח נורמלית וחולנית היא חיונית. תרבות הפריה חוץ גופית סטנדרטית של תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים נשאר לקוי בגלל יכולת צמיחה מוגבלת מאוד ותנאים לא פיזיולוגיים (2D) עם אובדן מהיר של פנוטיפ (לסקירה מפורטת יותר, ראה16). תרביות כדור 3D (pituispheres) הוקמו מתאי גזע בלוטת יותרת המוח כפי שזוהו על ידי אוכלוסייה צדדית ופנוטיפ SOX2 + 2,3,4. הפיתוספירות גדלות באופן קלונלי מתאי הגזע, מבטאות סמני גזע ומראים יכולת בידול לסוגי התאים האנדוקריניים. עם זאת, הם אינם מתרחבים במידה ניכרת תוך הצגת מעבר מוגבלת בלבד (2-3 קטעים)3,4. מבנים דמויי כדור התקבלו גם מקבצי תאי גזע לא מנותקים של יותרת המוח כאשר הם מתורבתים ב-50% מטריגל מדולל במשך שבוע אחד, אך יכולת ההרחבה לא הוצגה17. הגישה pituisphere משמש בעיקר ככלי קריאה עבור מספרי תאי גזע, אבל יישומים נוספים מוגבלים על ידי יכולת הרחבה נחותה16.
כדי לטפל ולהתגבר על חסרונות אלה, מודל 3D חדש הוקם לאחרונה, כלומר, organoids, החל AL האנדוקרינית העיקרית של עכברים המכילים את תאי הגזע MZ ו parenchymal. הוכח כי האורגנוידים אכן נגזרים מתאי הגזע של בלוטת יותרת המוח, בנאמנות recapitulate הפנוטיפ שלהם18. יתר על כן, האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך, תוך שמירה איתנה על טבע הגבעול שלהם. לכן, הם מספקים שיטה אמינה להרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים לחקר מעמיק. מחקר כזה אינו בר השגה עם מספר מוגבל של תאי גזע שניתן לבודד מ יותרת המוח, אשר גם אינם ניתנים להרחבה בתנאים 2D16. הוכח כי organoids הם כלים יקרי ערך ואמינים לחשוף תכונות תאי גזע בלוטת יותרת המוח חדשים (מתורגם in vivo)14,18. חשוב לציין, מודל organoid משקף בנאמנות את מצב הפעלת תאי הגזע בלוטת יותרת המוח כפי שהתרחשו במהלך נזק לרקמות מקומיות והתבגרות יילודים, מראה יעילות היווצרות משופרת ושכפול מסלולים מולקולריים upregulated 14,18. לפיכך, מודל organoid שמקורו בבלוטת יותרת המוח הוא חדשני ורב עוצמה יותרת המוח ביולוגיה של תאי גזע מודל מחקר, כמו גם כלי קריאת הפעלת תאי גזע.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הקמתם של אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח של העכבר. לשם כך, האל על מבודדת ומנותקת לתאים בודדים, המוטמעים במטריצה חוץ-תאית המחקה מטריגל (להלן ECM). הרכבה תא-ECM הוא אז תרבית במדיום מוגדר, בעצם המכיל גורמי גדילה של תאי גזע ורגולטורים עובריים בלוטת יותרת המוח (המכונה עוד יותרת המוח ‘מדיום organoid בלוטת יותרת המוח’ (PitOM)18; טבלה 1). לאחר האורגנוידים מפותחים במלואם (לאחר 10-14 ימים), ניתן להרחיב אותם עוד יותר מעבר רציף שוקת ונתונים לחקירה נרחבת במורד הזרם (למשל, אימונופלואורסצנטיות, RT-qPCR, ותמלול בתפזורת או חד-תאית; איור 1). בטווח הארוך יותר, צפוי כי organoids תא גזע בלוטת יותרת המוח יסלול את הדרך תיקון רקמות גישות ורפואה רגנרטיבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
האורגנוידים שמקורם באל, כמתואר כאן, מייצגים מודל מחקר רב עוצמה לחקר תאי גזע בלוטת יותרת המוח במבחנה. נכון לעכשיו, גישה זו organoid הוא הכלי הזמין היחיד כדי אמין וחזק לגדול ולהרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקרי. מודל אורגנויד בלוטת יותרת המוח נגזר מתאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע פלוריפוטנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר KU Leuven והקרן למחקר מדעי (FWO) – פלנדריה. E.L. (11A3320N), ו- C.N. (1S14218N) נתמכים על ידי מלגת דוקטורט מ- FWO / FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
