Entwicklung von Organoiden aus der Hypophyse der Maus als In-vitro-Modell zur Erforschung der Hypophysenstammzellbiologie

Die Hypophyse ist eine winzige endokrine Drüse, die sich an der Basis des Gehirns befindet, wo sie mit dem Hypothalamus verbunden ist. Die Drüse integriert periphere und zentrale (hypothalamische) Eingänge, um eine abgestimmte und koordinierte Hormonfreisetzung zu erzeugen, wodurch nachgeschaltete endokrine Zielorgane (wie Nebennieren und Gonaden) reguliert werden, um geeignete Hormone zum richtigen Zeitpunkt zu produzieren. Die Hypophyse ist der Schlüsselregulator des endokrinen Systems und wird daher zu Recht als Masterdrüse¹ bezeichnet.

Die Hypophyse der Maus besteht aus drei Lappen (Abbildung 1), d. h. dem Vorderlappen (AL), dem Zwischenlappen (IL) und dem hinteren Lappen (PL). Die große endokrine AL enthält fünf hormonelle Zelltypen, einschließlich Somatotropen, die Wachstumshormon (GH) produzieren; Lactotrope, die Prolaktin erzeugen (PRL); Kortikotrope, die das adrenocorticotrope Hormon (ACTH) absondern; Thyreotrope, die für die Produktion von Schilddrüsen-stimulierenden Hormonen (TSH) verantwortlich sind; und Gonadotrope, die luteinisierendes Hormon (LH) und follikelstimulierendes Hormon (FSH) bilden. Die PL besteht aus axonalen Projektionen aus dem Hypothalamus, in denen die Hormone Oxytocin und Vasopressin (antidiuretisches Hormon) gespeichert sind. Das IL befindet sich zwischen dem AL und dem PL und beherbergt Melanotrope, die Melanozyten-stimulierendes Hormon (MSH) produzieren. In der menschlichen Hypophyse bildet sich die IL während der Entwicklung zurück, und Melanotrope werden innerhalb der AL¹ verteilt. Neben den endokrinen Zellen enthält die Hypophyse auch einen Pool von Stammzellen, die im Wesentlichen durch den Transkriptionsfaktor SOX2 2,3,4,5,6 gekennzeichnet sind. Diese SOX2⁺-Zellen befinden sich in der Randzone (MZ), der Epithelauskleidung der Spalte (ein embryonales Restlumen zwischen AL und IL), oder sind als Cluster über das Parenchym des AL verteilt, wodurch zwei Stammzellnischen in der Drüse vorgeschlagen werden (Abbildung 1) ^2,3,4,5,6.

Angesichts der unverzichtbaren Natur der Hypophyse ist eine Fehlfunktion der Drüse mit einer schweren Morbidität verbunden. Hyperpituitarismus (gekennzeichnet durch Übersekretion eines oder mehrerer Hormone) und Hypopituitarismus (fehlerhafte oder fehlende Produktion eines oder mehrerer Hormone) können durch neuroendokrine Hypophysentumoren (PitNETs; z. B. ACTH-produzierende Tumoren, die zur Morbus Cushing führen) oder durch genetische Defekte (z. B. GH-Mangel, der zu Zwergwuchs führt) verursacht ^werden7. Darüber hinaus sind Hypophysenchirurgie (z. B. zur Entfernung von Tumoren), Infektionen (z. B. Hypothalamus-Hypophysen-Tuberkulose oder Infektionen nach bakterieller Meningitis oder Enzephalitis), Sheehan-Syndrom (Nekrose aufgrund unzureichender Durchblutung aufgrund von starkem Blutverlust bei der Geburt), Hypophysenapoplexie und traumatische Hirnverletzung weitere wichtige Ursachen für die Hypophysenunterfunktion⁸ . Es wurde gezeigt, dass die Hypophyse der Maus die Regenerationsfähigkeit besitzt und in der Lage ist, lokale Schäden zu reparieren, die durch transgene Ablation endokriner Zellen verursacht werden ^9,10. Die SOX2⁺-Stammzellen reagieren akut auf die zugefügte Verletzung und zeigen einen aktivierten Phänotyp, der durch eine erhöhte Proliferation (was zu einer Stammzellexpansion führt) und eine erhöhte Expression von stammesbedingten Faktoren und Signalwegen (z. B. WNT / NOTCH) gekennzeichnet ist. Darüber hinaus beginnen die Stammzellen, das abgetragene Hormon zu exprimieren, was schließlich zu einer erheblichen Wiederherstellung der erschöpften Zellpopulation über die folgenden (5 bis 6) Monate ^9,10 führt. Auch während der neonatalen Reifungsphase der Drüse (die ersten 3 Wochen nach der Geburt) gedeihen die Hypophysenstammzellen in einem aktivierten Zustand 6,11,12,13, während das Altern des Organismus mit einer verminderten In-situ-Stammzellfunktionalität verbunden ist, aufgrund einer zunehmenden entzündlichen (Mikro-) Umgebung beim Altern (oder “entzündlich”)^10,14 . Darüber hinaus ist die Tumorgenese in der Drüse auch mit der Stammzellaktivierung assoziiert ^7,15. Obwohl die Stammzellaktivierung in mehreren Situationen des Hypophysenumbaus nachgewiesen wurde (überprüft in ^7,16), bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen unklar. Da In-vivo-Ansätze (wie die Linienverfolgung bei transgenen Mäusen) kein klares oder umfassendes Bild von Hypophysenstammzellen geliefert haben, ist die Entwicklung zuverlässiger In-vitro-Modelle zur Erforschung der Stammzellbiologie in normaler und kranker Hypophyse unerlässlich. Die Standard-In-vitro-Kultur primärer Hypophysenstammzellen ist aufgrund der sehr begrenzten Wachstumskapazität und der nicht-physiologischen (2D) Bedingungen mit schnellem Verlust des Phänotyps nach wie vor unzureichend (für einen detaillierteren Überblick siehe¹⁶). 3D-Kugelkulturen (Pituisphären) wurden aus Hypophysenstammzellen etabliert, die durch die Nebenpopulation und den SOX2⁺-Phänotyp ^2,3,4 identifiziert wurden. Die Pituisphären wachsen klonal aus den Stammzellen, exprimieren Stammheitsmarker und zeigen Differenzierungsfähigkeit in die endokrinen Zelltypen. Sie dehnen sich jedoch nicht wesentlich aus, während sie nur eine begrenzte Durchlässigkeit aufweisen (2-3 Passagen)^3,4. Kugelartige Strukturen wurden auch aus nicht dissoziierten Hypophysenstammzellclustern erhalten, wenn sie 1 Woche lang in 50% verdünntem Matrigel kultiviert wurden, aber die Erweiterbarkeit wurde nicht gezeigt¹⁷. Der Pituisphere-Ansatz wird hauptsächlich als Auslesewerkzeug für Stammzellzahlen verwendet, aber weitere Anwendungen sind durch eine geringere Expansionskapazität^{begrenzt 16}.

Um diese Mängel zu beheben und zu überwinden, wurde kürzlich ein neues 3D-Modell entwickelt, d.h. Organoide, ausgehend von der großen endokrinen AL von Mäusen, die die MZ- und parenchymalen Stammzellen enthalten. Es hat sich gezeigt, dass die Organoide tatsächlich aus den Stammzellen der Hypophyse gewonnen werden und ihren Phänotyp¹⁸ originalgetreu rekapitulieren. Darüber hinaus sind die Organoide langfristig expandierbar, während sie ihre Stammnatur robust beibehalten. Daher bieten sie eine zuverlässige Methode, um primäre Hypophysenstammzellen für eine tiefgreifende Exploration zu erweitern. Eine solche Exploration ist mit der begrenzten Anzahl von Stammzellen, die aus einer Hypophyse isoliert werden können, die auch unter 2D-Bedingungen nicht erweiterbar sind, nicht erreichbar¹⁶. Es hat sich gezeigt, dass die Organoide wertvolle und zuverlässige Werkzeuge sind, um neue Merkmale von Hypophysenstammzellen (übersetzbar in vivo) ^{aufzudecken14,18}. Wichtig ist, dass das Organoidmodell den Aktivierungsstatus der Hypophysenstammzellen während lokaler Gewebeschäden und neonataler Reifung getreu widerspiegelt, eine verbesserte Bildungseffizienz zeigt und hochregulierte molekulare Wege repliziert^14,18. Daher ist das aus der Hypophyse abgeleitete Organoidmodell ein innovatives und leistungsfähiges Forschungsmodell für die Hypophysenstammzellbiologie sowie ein Werkzeug zum Auslesen der Stammzellaktivierung.

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Etablierung von aus der Hypophyse stammenden Organoiden der Maus. Zu diesem Zweck wird die AL isoliert und in einzelne Zellen dissoziiert, die in das extrazelluläre Matrix-nachahmende Matrigel (im Folgenden als ECM bezeichnet) eingebettet sind. Die Zell-ECM-Anordnung wird dann in einem definierten Medium kultiviert, das im Wesentlichen Stammzellwachstumsfaktoren und Hypophysen-Embryonalregulatoren enthält (im Folgenden als “Hypophysen-Organoid-Medium” (PitOM)¹⁸ bezeichnet; Tabelle 1). Sobald die Organoide vollständig entwickelt sind (nach 10-14 Tagen), können sie durch sequentielles Passieren weiter expandiert und einer umfangreichen nachgelagerten Exploration unterzogen werden (z. B. Immunfluoreszenz, RT-qPCR und Bulk- oder Einzelzelltranskriptomik; Abbildung 1). Längerfristig wird erwartet, dass die Hypophysenstammzell-Organoide den Weg für Gewebereparaturansätze und regenerative Medizin ebnen werden.