多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

1.O2感受性プローブを内蔵したスフェロイドの高スループット生成 マイクロパターンアガロース被覆組織培養プレートの作製注:マイクロパターン化されたアガロースコーティング組織培養プレートは、複数の実験複製または大きな回転楕円体数が必要なバイオプリンティングおよびその他の用途のために、多数のスフェロイド(PDMSスタンプあたり1585、 材料表を参照)の同時生成に使用されます。 すべての滅菌材料および器具(ヘラおよびピンセット)は、可能な場合はオートクレーブ処理またはフィルター滅菌によって準備します。リサイクル可能なPDMSスタンプ33 をアガロースから洗浄し、70%エタノールに無菌的に保管する。回転楕円体生成の少なくとも1日前にこれを行う。 マイクロパターンのPDMSスタンプを保管バイアルから滅菌ペトリ皿に移し、滅菌層流気流条件下で滑らかな表面を10分間風乾します。 マイクロパターン化された表面を有する各スタンプを12ウェル滅菌組織培養プレートのウェルの中央に上方(および平滑表面下方)に置く。開いた蓋で1〜2分間空気乾燥させる。メモ:乾燥スタンプだけがプラスチック表面に完全に固執し、手順中に取り付けられたままになるため、余分な液体を蒸発させることは非常に重要です。 きれいな200mLのガラス瓶に1.5gのアガロースを秤量し、50mLの滅菌蒸留水を加え、蓋をして電子レンジで溶かして50mLの3%均質アガロース溶液を作る。警告: アガロース溶液は非常に高温であるため、取り扱いには注意が必要です。溶融手順の直後に振とうすると、熱いアガロース溶液がバブリングを開始し、容器から爆発する可能性があります。時折の外傷を避けるために、アガロース溶液で最大50%の体積で満たされた十分に大きな容器を使用してください。 滅菌血清学的ピペットを用いて、挿入されたPDMSスタンプを完全に覆うために、12ウェル細胞培養プレートの各ウェルに〜2mLの熱いアガロース溶液を直ちに加える。アガロースを放置し、プレート蓋を開けた状態で滅菌気流下でインキュベートして20分間固化させる。注:PDMSスタンプ除去後のアガロースマイクロウェルの完全性を確保するために、アガロース層はPDMSスタンプよりも少なくとも2倍厚くする必要があります(図1C)。 滅菌された小さなヘラを使用して、各ウェルに埋め込まれたPDMSスタンプでアガロースを正確に裏返し、滑らかなスタンプ表面を上にします。スタンプの滑らかな上面に約200μLの滅菌水を加え、ヘラでアガロースから静かに取り外し、ウェルから取り出します。マイクロウェルの損傷は避けてください。 直接使用するために、対応する滅菌細胞培養培地1mLをアガローススタンプに加える。プレートを蓋で覆い、4°Cで一晩インキュベートした。 長期保存(4°Cで最大2週間)には、PBS溶液(培地の代わりに)を使用してください。アガロースを乾燥させないでください。使用前に、アガロースマイクロパターンプレートをCO2 インキュベーター内で37°Cで1時間温める。注:インキュベーションは、アガロースマイクロウェルから気泡を平衡化および除去するために必要です。プロトコルステップ 1.2 に進みます。 Oの準備2 プローブ搭載回転楕円体hDPSCおよびHUVEC細胞株の培養には、それぞれ10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したα最小必須培地(MEM)、および増殖因子補充内皮細胞増殖培地2を使用する。hDPSC/HUVECヘテロ細胞スフェロイド増殖培地を調製するには、HUVECとhDPSC増殖培地を1:1の比率で添加する。 70%〜90%コンフルエントな細胞培養物を調製する(〜3〜4日間の調製)。ヘテロ細胞スフェロイドの生成のために、hDPSCおよびHUVEC培養物をそれぞれ調製する。注: HUVEC および hDPSC の通過番号は 8 を超えてはなりません。細胞培養物の急速な増殖を確実にするために、3〜4日ごとに新しいフラスコを使用して、常に全細胞培養物の1/3(70%〜80%コンフルエント)で分割する。 70%〜90%コンフルエントな細胞培養物を、予め加温した(37°C)PBS(75cm2フラスコあたり10mL)ですすいでください。解離酵素溶液(0.05%トリプシンおよび1 mM EDTA;75 cm2フラスコあたり1 mL)を加え、細胞剥離のために5%CO2、湿度95%で37°Cで3〜5分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞剥離を確認する。完了したら、10Sを含む完全な細胞培養培地(解離溶液1mLあたり5mLの培地)でトリプシンを中和する。注:解離酵素溶液への細胞の過剰暴露は、生存率に影響を与える可能性があるため、防止してください。 低FBS培地で培養したHUVECの場合、トリプシン処理した細胞培養物に100Sを0.5 mL添加してトリプシン中和を行い、遠心分離を行い、細胞をそれらの増殖培地に移した。注:得られた細胞懸濁液は、1mLあたり約100万個の細胞を含むべきである。必要に応じて、追加の遠心分離工程をプロトコールに追加して、細胞懸濁液を濃縮することができる。 10 mL血清学的ピペットの上部に1000 μLのピペットチップを用いたピペッティングによって細胞凝集物を解離させ、単一細胞懸濁液を得た。計数チャンバー(ノイバウアー型血球計数器または代替物)を使用して、細胞懸濁液34の1mLあたりの細胞数を計数する。細胞懸濁液を1mLあたり500,000細胞に希釈する。1:1のスフェロイド比のヘテロセルhDPSC/HUVECの場合、等量の対応する細胞懸濁液を加えて、1mLあたり500,000細胞の最終細胞濃度を有する。注:マイクロパターン化されたアガローススタンプに添加された懸濁液中の細胞濃度の変化は、アガローススタンプのマイクロウェルあたりの細胞数に依存する産生されたスフェロイドの平均サイズを変更することを可能にする。記載されたセットアップでは、〜300個の細胞のスフェロイドが、1585個のマイクロウェルを有するアガローススタンプ上の500,000個の細胞を含む1mLから生成される。 濃縮O2 プローブ(ナノ粒子、1mg/mLストック)溶液を調製細胞懸濁液に終濃度5μg/mLとなるように加える。注:O2センシングナノ粒子の存在下での回転楕円体形成は、効率的な染色を提供し、最低5日間保存される(図1D)。対照的に、ナノ粒子による予め形成された多細胞スフェロイドの染色は効率が悪くなる15。 12ウェルのアガロースコーティングされた細胞培養プレートのマイクロパターン化されたウェル(ステップ1.1.7を参照)の1mLの古い培地を、調製した細胞懸濁液1mL(1mLあたり500,000細胞、5μg/mLのO2 プローブ)と交換する。スフェロイドをCO2インキュベーター内でO2 プローブの連続存在下で2 〜5日間培養し、スフェロイド形成および圧縮中のその負荷を確実にする。注: スフェロイド培養では、培地の過剰な蒸発を避けてください。必要に応じて、慎重に(マイクロウェル内のスフェロイドを乱さないでください)、追加のO2 プローブ希釈液とともに0.2〜0.5mLの培養培地を加えます。 スフェロイド形成後、成長培地をプローブのない新鮮なものと交換する。プローブ染色は、生成されたスフェロイド中に7〜14日以上保存され、スフェロイド中のシグナルの長期モニタリングが可能になります。 2. 回転楕円体バイオプリンティング 注:スフェロイドは、メタクリルアミド修飾ゼラチン(GelMA)ベースのバイオインクでバイオプリントされています。以下、バイオインク成分、バイオインク調製の手順、およびバイオプリンティングについて説明する。 バイオインク調製 層流35下の培地中に10%(w/v)GelMA溶液(2mL)を調製する:15mL チューブに置換度78の滅菌GelMAを0.2g秤量し、1.9mLのα-MEMを加え、37°C(〜2時間)のロータリーシェーカー上で混合して溶解させる。注:スフェロイドや光開始剤Li-TPO-Lなどの他の化合物は後で添加されるため、培地の全量を加えないでください。 ピペッティングによってマイクロパターン化されたウェルにスフェロイドを再懸濁し、15mLチューブに集める。PBSで追加のすすぎを行い、すべてのスフェロイドがアガロースマイクロウェルから収集されるようにします。アガロースのフレークがバイオプリンティング中に針を塞ぐ可能性があるため、アガロースマイクロウェルに触れたり傷つけたりしないでください。 スフェロイドを遠心分離により、15 mL チューブで 300 x g で 20 °C で 5 分間収集します。 上清をピペットで吸引し、スフェロイドに50μLの培地を加え、穏やかなピペッティングによってそれらを再懸濁する。 スフェロイド混合物を温かいGelMA溶液に加え、穏やかなピペッティングによって混合する。スフェロイド濃度を、バイオプリンティング用バイオインク mL あたり 6340 ~ 12860 個のスフェロイド (4 ~ 8 個のマイクロパターンから) に維持します。高濃度の回転楕円体は印刷針のブロッキングを引き起こしやすいため、避けてください。 フィルター滅菌した光開始剤Li-TPO-L原液(32mg/mL)を二重結合数に対して終濃度2モル%で加え、穏やかなピペッティング36、37により混合する。注: Li-TPO-L の量は、次の式に従って計算できます。光開始剤の体積(PI)=(ゲルMAの0.000385モルNH2-基/g×294.10gのLi-TPO-L/モル×0.78×0.02)/0.032gのLi-TPO-L/mLの0.2gのゲルMA=0.0107mLのLi-TPO-Lストック バイオプリンティング手順 CAD での足場の設計については、 補足プロトコル 1 の手順を参照してください。デザインをバイオプリントするには、次の手順に従います。 滅菌された3ccカートリッジの端をチップキャップ(ルアーロック)で閉じ、ピペッティングでバイオインクで満たします。プランジャーをカートリッジに挿入します。カートリッジを逆さまにして先端キャップを取り外し、カートリッジからの空気がすべて取り除かれるまでプランジャーをバイオインクの方に押します。注:GelMAバイオインクとカートリッジの側面との接触は、バイオインクのゲル化によるプランジャーの動きを妨げる可能性があるため、避けてください。 バイオインクをバイオプリンターの加熱マントルで23°C(20~30分)で冷却させます。カートリッジ上部の圧力アダプタをねじ込みます。バイオインクが漏れないように入口チューブのクリップを閉じ、カートリッジに22Gの円錐形PEニードルを取り付けます。針のサイズと直径を足場の設計と回転楕円体の直径と濃度に適合させます。注:汚染を防ぐために、口内マスクとスプレー手袋を着用してください。 バイオプリンターに70%エタノールをスプレーし、吸収紙で拭き取ってください。カートリッジを押出ベースのプリントヘッドの加熱マントルに取り付けます。圧力インレットを差し込み、インレットのクリップを開きます。デザインのGコードファイルを印刷ソフトウェアにロードします。 針の長さ測定を開始します。滅菌ペトリ皿に少量のバイオインクを分配して印刷圧力を調整します。0.025〜0.045MPaの印刷圧力は、GelMAベースのバイオインク38の印刷に典型的である。 6穴プレートを取り付け、ウェルプレートを開けてフードを閉じ、印刷を開始します。印刷後、足場を5°Cで10分間物理的に架橋させ、印刷した足場にUV LEDランプ(365nm、メーカーによると500mW)を60秒間照射します。注:UV架橋時間は、UV光の特性、光開始剤の種類および濃度、所望の足場架橋度、膨潤、および弾性率に依存する。 100 U/mLのペニシリンおよび100 μg/mLのストレプトマイシン(P/S)を含む対応する増殖培地を、バイオプリントグリッド(6ウェル細胞培養プレートのウェルあたり2 mL)を有するすべてのウェルに直ちに添加する。 顕微鏡観察を開始するまで37°CのCO2 インキュベーター内で培養する。バイオプリントされたコンストラクト顕微鏡では、印刷されたワッフルグリッドを顕微鏡観察皿に移し、イメージングメディアで覆い、ステップ3.2および3.3に進みます。注:浮遊バイオプリント構築物の場合、それらは、細胞生存率に影響を与えることなく、例えば、細胞適合性接着剤を用いて顕微鏡ディッシュ内で固定されなければならない。倒立顕微鏡転写の場合、バイオプリントを顕微鏡製ガラス底ディッシュに、試料の望ましくない浮遊を避けるために、イメージング媒体(〜200〜500μL、画像化媒体組成についてはステップ3.1への注を参照)で覆う。追加の蛍光プローブによる染色は、バイオプリントされた構築物を顕微鏡ディッシュに移す前に、細胞培養ディッシュ内で行うことができる(ステップ3.1.6を参照のこと)。 3. 生体作製組織におけるスフェロイド酸素化のレシオメトリック蛍光生顕微鏡 注:O2プローブのレシオメトリック強度応答(R)を実際の低酸素レベルに変換するには、プローブ応答を24に記載した手順を使用して較正する必要があります。ただし、レシオメトリック校正は機器固有であり、T/O2/CO2制御インキュベーター(常に利用できるとは限らない)の設置が必要なため、半定量比検出の使用が好ましい選択肢です。 ライブイメージング解析のための回転楕円体の準備 この工程中のスフェロイド付着のために、滅菌顕微鏡ディッシュをコラーゲンIVおよび/またはポリ−D−リジンで予めコーティングするか、または市販のもの39を使用する。顕微鏡皿と顕微鏡の対物レンズの作動距離やその他の特性との互換性を確認してください。注:マルチパラメータイメージングの場合、すべての追加の染色手順は、蒸発、浸透圧ショック、またはその他のストレスから細胞を保護する十分な量の培地を含む培養プレート皿で行う必要があります。使用前にイメージング培地を調製し、予備温めてください:DMEMに炭酸水素ナトリウム(1.2 g/L)、HEPES-Na、pH 7.2(10 mM)、ピルビン酸ナトリウム(1 mM)、L-グルタミン(2 mM)、およびグルコース(5 mM)を添加(フェノールレッドなし)。 1mLピペットを用いて、予め染色されたO2プローブスフェロイドをアガロースマイクロウェルから穏やかに洗い流す。回転楕円体がまだ媒体中に浮かんでいる間、それらを15mLの円錐形の底管に移す。 マイクロパターン化されたウェルからのすべてのスフェロイドの収集を確実にするために、追加の1mLの培養培地でウェルを1〜3回すすぎ、すべてのスフェロイド懸濁液を1つのバイアルに組み合わせる。バイアルを垂直位置に最大10分間放置して、スフェロイドがバイアルの底に落ち着き、目に見えるペレットを形成します。 回転楕円体を乱さないようにチューブからメディアを慎重に取り出します。顕微鏡サンプル皿あたり少なくとも20個のスフェロイドに十分であるであろう量の新鮮な培養培地にそれらを穏やかに再懸濁する。これにより、培養培地の使用が最小限に抑えられ、イメージング中のスフェロイドの位置が簡素化されます。注: カバーガラスに取り付けられたμチャンバー 12 ウェルプレート ( 材料表を参照) のオートクレーブ可能なシリコン部分を、ウェルあたり最大メディア容量 300 μL の顕微鏡サンプル皿 (24 x 60 mm、厚さ #1) として使用します。この培養チャンバのシリコン部分は、皿に付着させたときに滅菌し、他のプラスチックおよびガラス表面と共に再利用することができる。 直ちに等量の回転楕円体懸濁液を各顕微鏡検査皿/ウェルに加える。スフェロイドをCO2 インキュベーター内で37°Cで1時間放置し、顕微鏡観察皿の表面に付着させた。他の色素の使用と相まって酸素化分析のためにステップ3.1.6を続行する。簡単な酸素化分析を行うには、ステップ 3.1.7 に進みます。注: インキュベーション時間 (3時間)は、スフェロイドから顕微鏡ディッシュ表面への細胞の移動およびそれらのリアルタイム酸素化の影響により、3D組織の部分的または完全な喪失をもたらし得る。 (オプション)染色濃度に希釈した蛍光プローブを含むプローブと培地を慎重に交換し、最適な強度に達するまでさらに1時間インキュベーションを続けます。培地交換中のスフェロイドの除去を避けるため、顕微鏡ディッシュの端から200μLのピペットで培地を慎重に吸引し、顕微鏡ディッシュ内で培地添加を横向きに行う。ステップ 3.1.7 に進みます。注:多細胞凝集体における拡散の悪いプローブで効率的に染色するには、ローディング濃度および/または時間を延長してください。使用前に、予備実験でオプションのプローブ負荷パラメータを決定します。 顕微鏡観察皿から培地を取り出し、イメージングメディアで1回すすいでください。正確な量のイメージング培地をサンプルに加える(例えば、12ウェル培養プレートのμチャンバーのマイクロウェルあたり300μL)。ステップ 3.2 に進みます。 画像取得イメージングの30分前に顕微鏡および接続されたデバイス(すなわち、励起光源、カメラ、コンピュータ、インキュベーター、およびその他の動作電子ブロック)の電源を入れてウォームアップし、測定条件(温度、O2の異なる値、5%CO2、必要に応じて湿度)に平衡化します。正確な顕微鏡セットアップで提供される顕微鏡オペレーティングソフトウェアを起動します。メモ: 記載されているプロトコルは、CellSens Dimension ソフトウェア v.3 に適合しています。 適切な励起(光源、電力)および発光フィルタ、および選択した蛍光(または燐光)プローブの露光時間を選択します。マルチパラメータ、3D、およびタイムラプス顕微鏡分析の場合は、自動測定シーケンスプロトコルを操作顕微鏡ソフトウェアに記述します。 予備実験において、各プローブ、実験モデル、および細胞株に最適なイメージング設定を経験的に決定する。特に3Dおよびタイムラプス測定実験において、設定が基準(I参照)およびO2 センシング(Iセン)チャネルにおける最小のフォトブリーチングおよび強度比(R = I参照 /Iセン)への影響を最小限に抑えていることを確認してください。 顕微鏡検査ステージ上に染色された回転楕円体を含む顕微鏡皿をセットアップする。低倍率対物レンズを使用して、透過光でサンプルをプレビューし、回転楕円体に予備的な焦点を合わせ、画像の中心に配置します。注:標準の4倍から10倍の倍率の空気対物レンズはプリフォーカスに十分ですが、実際の測定では、皿に取り付けられた回転楕円体に十分な作動距離を持つ開口数(NA)が0.6以上(空気または水浸漬)の対物レンズで20倍から40倍をお勧めします。 必要な高倍率の対物レンズを作業位置に持参してください。回転楕円体の中央(赤道)断面の透過光モードに注目します。3Dオブジェクトにおける酸素化は、イメージングセクションの深さに直接依存します。これを確実にするには、グループ内およびグループ間の類似の断面 (スフェロイドの中央断面、上部/下部断面など) を分析します。注:O2 勾配の詳細かつ正確な分析と再構成のために、コンフォカル、ライトシート、または2光子(最良の選択肢)顕微鏡を使用してZスタックをスキャンして生成することをお勧めします。すべての断面からの信号が同時に収集される従来の広視野顕微鏡では、O2 勾配の正確な分析ではなく、中間断面による平均推定を行うことができます。この場合、中央の断面は焦点断面として定義され、回転楕円体は最大直径を持ち、境界に鋭い焦点が当てられます。 マルチパラメトリックイメージングに適用されるO2 プローブおよびその他の蛍光プローブの基準および高感度スペクトルチャネルの蛍光/リン光シグナルの収集に関する設定を調整します。 定量的な強度ベースの比較では、グループ内のすべての測定対象物に対して、露光時間、励起光源電力、解像度、スキャン速度、ピンホールサイズなど、選択した同じイメージング設定を適用します。メモ:ベンダーが提供する多くの顕微鏡ソフトウェアバージョンでは、強度比の自動計算が可能です。O2プローブの基準および高感度チャネルの強度測定にマージする機能を適用し、ここで用いるイメージングソフトウェアで実験マネージャにイメージング取得プログラムを書き込む場合。 O2プローブの参照および高感度スペクトルチャネル、および必要に応じて追加の蛍光チャネルのために、同じ光学セクションから画像を収集します。このプロトコルでは、赤色リファレンス(例 = 580 nm、em. = 650 nm)および近赤外 O2 感受性スペクトル (例: 635 nm、em. = 760 nm) スペクトルを持つ MMIR1 プローブを使用します。 手順 3.2.5 ~ 3.2.8 を繰り返して、統計分析に十分な数のデータ ポイントを収集します。異なる薬物、ミトコンドリアのアンカプラーまたは電子輸送鎖の阻害剤および他の速効性化合物による治療時に急速に進化する細胞応答の動的分析のために、タイムラプス測定モードを使用する(ステップ3.2.10)。 サンプルの定期的な照明を伴う37°Cでイメージング媒体中で測定を行い、目的の蛍光色素(例えば、O2 プローブリファレンスおよびセンシングチャネル)のシグナルを、例えば、2分間にわたって10秒ごとに収集する。 定期的な測定が完了したら、すべての回転楕円体のフォーカスチェックを実行して、イメージング中にフォーカスドリフトがなかったことを確認します。必要に応じて繰り返します。ステップ 3.3 に進んでデータ分析を行います。注:細胞刺激および薬物添加なしで、タイムラプス測定を行って、参照色素、例えば、フルオレセイン、カルセイングリーンAMまたはテトラメチルローダミンメチルエステルと比較して、光安定性を評価することができる。 画像プレゼンテーション注:ここでは、Oを自動的に計算する方法について説明します2 スフェロイドにおけるプローブ強度比(R)は、撮像ソフトウェアにおける比解析機能を用いて、画素別R計算を適用し、回転楕円体顕微鏡断面の偽色R分布画像を生成する。Rは、単純な式R=Iを適用することによって、回転楕円体画像の同じ関心領域(ROI)から収集された参照スペクトルチャネルおよび高感度スペクトルチャネルの強度データから手動で計算することもできる。参照/Iセンス24,34.対応する顕微鏡ソフトウェアで生画像から強度データを抽出できない場合、強度データは、ImageJまたはフィジーなどのプログラムを使用して取得することができる(「考察」を参照)。マージモードで作成された参照および敏感なスペクトルチャンネルからのO2プローブ強度データを含む.vsiファイルを開きます。メジャーメニューから比分析機能ウィンドウを開きます。参照チャンネルの強度を分子として選択し、感度チャンネルの強度を R 計算の分母として選択します。注:Rを計算するための基準信号と敏感な信号の逆の比率も可能ですが、この場合、RはO2の増加とともに減少します。 対応する強度しきい値設定を各スペクトルチャンネルに適用して、マージされた強度イメージから背景を減算します。画像の背景が均一に黒くなるまで、しきい値を増やし続けます。しきい値パラメーターは、比較分析で使用されるデータ セット内のすべての回転楕円体画像に等しく適用します。メモ: プレビューウィンドウを使用して、スフェロイドの予備計算された偽色 R 画像を観察することにより、しきい値設定を最適化します。しきい値フィールドの現在の値よりも低い強度を持つすべてのピクセルは、R 分析から削除され、黒い斑点として表示されます。閾値適用後、スフェロイド蛍光に対応する領域のみを可視化すべきである。独立したスペクトルチャンネルの平均背景強度(回転楕円体のない領域)の予備推定は、画像に対する適切な閾値の選択を簡素化します。さらに、対応する透過光スフェロイド画像からマージされた蛍光画像に同定されたスフェロイドROI境界の適用は、非バックグラウンド信号強度の過度の減算を防止する閾値パラメータの正確な決定に役立つ。 分子と分母の強度の背景設定は、しきい値アプリケーションで背景が既に減算されているため、0 のままにします。 プレビュー画像がRグラデーションの所望の解像度を提供するまで、比率画像に対するスケーリング係数(Scale)を調整します。スケーリングパラメータは、比較解析で使用されるデータセット内のすべての回転楕円体画像に等しく適用します。注: スケーリング パラメーターは、R イメージにできるだけ多くの情報が含まれ、R 数値データの解像度係数として表示できるように、十分な大きさ (少なくとも 1,000) にする必要があります。 調整されたパラメータを回転楕円体画像に適用するには、「 適用」を押します。ツールウィンドウメニューから表示調整ウィンドウで画像の明るさとコントラストを調整します。 比率分布ヒストグラムのリンク制限とリンク解除限界を手動で決定するには、「表示の調整」ウィンドウの固定スケーリング・オプションを使用します。これにより、R パラメーターの表示の偽色バーの範囲が決まります。注: 異なるグループ間で回転楕円体画像を比較するには、すべての分析サンプルで同様のカラーバー範囲を維持することが重要です。Rパラメータの変更の範囲はグループ間で異なる可能性があるため、選択した偽色バーの範囲は、すべての分析グループの分布ヒストグラムに対して普遍的である必要があります。 回転楕円体は、しばしば理想的には球状ではなく、回転楕円体直径が回転楕円体の中心(しばしば低酸素コア)を通って引かれた最長の線であると仮定する。測定メニューの線形定規機能を使用して、回転楕円体の直径を決定します。データをスプレッドシートのテーブルファイルとしてエクスポートします。 必要なサイズ(できるだけ小さい)および形状(例えば、円形)のROIを選択し、それを回転楕円体の周囲および低酸素コアに適用する。ROIを測定対象物に変換して、選択したROI内の平均R(周辺R-Rp およびコアR-Rc)を分析します。スプレッドシートと互換性のある表形式でデータをエクスポートします。注:回転楕円体はグループ間で同一のO2分布を持たず、低酸素コアは回転楕円体中心と完全に共局在化しない。解析を単純化および標準化するために、最も低酸素領域が回転楕円体の中心にある理想的なコアに対応すると仮定します。これらのゾーンで測定されたRcは、O2勾配範囲(Rp−Rc)および急峻度(Rp−Rc)/rの計算に適用され、ここでr(理想的には、周辺と低酸素コアROIとの間の距離)は、直径測定値から計算されたμm単位の回転楕円体のおおよその半径である。任意選択で、回転楕円体O2勾配は、回転楕円体直径に沿ってなされるRパラメータ変更(測定メニューの線プロファイルウィンドウ)の線形ラインプロファイルとして提示することができる。このデータは、スプレッドシートのテーブルファイルとしてエクスポートすることもできます。 回転楕円体の各顕微鏡セクションに測定値を適用して、回転楕円体直径、Rc およびRp のデータセットを取得し、さらなる計算および統計的比較を実行する。すべてのデータを 1 つのスプレッドシート ファイルに結合します。 異なる刺激に対するフォトブリーチングまたは動的応答のタイムラプス解析では、選択したROIをセット内の各画像の同じ座標に適用します。R パラメーターを比較するには、タイムラプス イメージ セットの最初のサイクルの R からのパーセンテージとして表示します。 フォトブリーチング解析では、複数のROIからRを使用して、各タイムラプスサイクルの平均Rをパーセンテージで計算し、変化を追跡します。 連続照明の12サイクル後の初期強度の減少が5%未満であった場合、フォトブリーチング効果は重要ではないと仮定する。動的変化をコントロールとしてフォトブリーチング曲線と常に比較して、レシオメトリックタイムラプス応答の有意性を確認します( 図2A、Bを参照)。 得られたパラメータから、データセット内の個々のスフェロイドについてr、(Rp−Rc)および(Rp−Rc)/rを計算する。コルモゴロフ-スミルノフまたは関連する検定によるデータ分布の正規性を分析します。データ分析に適した統計手法を選択し、データ表示の数値に進みます。注:ここに提示されたデータは正規分布しており、回転楕円体群間の統計的比較のためにp = 0.05での独立した t検定が実装された。