Modelo de lesión por puñalada del Tectum óptico adulto utilizando pez cebra y medaka para el análisis comparativo de la capacidad regenerativa
Summary
Se describe un modelo mecánico de lesión cerebral en el pez cebra adulto para investigar los mecanismos moleculares que regulan su alta capacidad regenerativa. El método explica crear una lesión por arma blanca en el tectum óptico de múltiples especies de peces pequeños para evaluar las respuestas regenerativas utilizando inmunotinción fluorescente.
Abstract
Mientras que el pez cebra tiene una capacidad superior para regenerar su sistema nervioso central (SNC), la medaka tiene una menor capacidad regenerativa del SNC. Se desarrolló un modelo de lesión cerebral en el tectum óptico adulto de pez cebra y medaka y se realizaron análisis histológicos y moleculares comparativos para dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la alta capacidad regenerativa de este tejido en estas especies de peces. Aquí se presenta un modelo de lesión por arma blanca para el tectum óptico adulto utilizando una aguja y análisis histológicos para la proliferación y diferenciación de las células madre neurales (NSC). Se insertó manualmente una aguja en la región central del tectum óptico, y luego los peces fueron perfundidos intracárdicamente y sus cerebros fueron disecados. Estos tejidos se crioseccionaron y evaluaron mediante inmunotinción contra los marcadores apropiados de proliferación y diferenciación de NSC. Este modelo de lesión tectum proporciona resultados robustos y reproducibles tanto en pez cebra como en medaka, lo que permite comparar las respuestas NSC después de la lesión. Este método está disponible para teleósteos pequeños, incluidos el pez cebra, la medaka y el killi africano, y nos permite comparar su capacidad regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) tiene una mayor capacidad para regenerar su sistema nervioso central (SNC) en comparación con otros mamíferos 1,2,3. Recientemente, para comprender mejor los mecanismos moleculares subyacentes a esta mayor capacidad regenerativa, se han realizado análisis comparativos de la regeneración tisular utilizando tecnología de secuenciación de próxima generación 4,5,6. Las estructuras cerebrales en el pez cebra y tetrápodos son bastante diferentes 7,8,9. Esto significa que se han desarrollado varios modelos de lesión cerebral utilizando peces pequeños con estructuras cerebrales y características biológicas similares para facilitar la investigación de los mecanismos moleculares subyacentes que contribuyen a esta mayor capacidad regenerativa.
Además, la medaka (Oryzias latipes) es un animal de laboratorio popular con una baja capacidad de regeneración cardíaca y neuronal10,11,12,13 en comparación con el pez cebra. El pez cebra y la medaka tienen estructuras cerebrales y nichos similares para las células madre neurales adultas (NSC)14,15,16,17. En el pez cebra y la medaka, el tectum óptico incluye dos tipos de NSC, células madre neuroepiteliales y células gliales radiales (CGR)15,18. Previamente se desarrolló una herida por arma blanca para el tectum óptico del pez cebra adulto, y este modelo fue utilizado para investigar los mecanismos moleculares que regulan la regeneración cerebral en estos animales 19,20,21,22,23. Este modelo de lesión por herida de puñalada de pez cebra adulto joven indujo neurogénesis regenerativa a partir de CGR 19,24,25. Esta herida por arma blanca en el tectum óptico es un método robusto y reproducible 13,19,20,21,22,23,24,25. Cuando se aplicó el mismo modelo de lesión a la medaka adulta, la baja capacidad neurogénica de las CGR en el tectum óptico de la medaka se reveló a través del análisis comparativo de la proliferación y diferenciación de las CGR después de la lesión13.
Los modelos de lesión por arma blanca en el tectum óptico también se han desarrollado en modelos de mummichog26, pero los detalles de la lesión del tectum no han sido bien documentados en comparación con la lesión telencefálica27. La lesión por arma blanca en el tectum óptico utilizando pez cebra y medaka permite investigar las respuestas celulares diferenciales y la expresión génica entre especies con capacidad regenerativa diferencial. Este protocolo describe cómo realizar una lesión por arma blanca en el tectum óptico con una aguja de inyección. Este método se puede aplicar a peces pequeños como el pez cebra y la medaka. Aquí se explican los procesos de preparación de muestras para análisis histológico y análisis de proliferación y diferenciación celular mediante inmunohistoquímica fluorescente y criosecciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un conjunto de métodos que se pueden utilizar para inducir lesiones por heridas de arma blanca en el tectum óptico utilizando una aguja para facilitar la evaluación de la proliferación y diferenciación de RGC después de una lesión cerebral. Las heridas de arma blanca mediadas por agujas son un método simple y eficientemente implementado que se puede aplicar a muchas muestras experimentales utilizando un conjunto estándar de herramientas. Se han desarrollado modelos de lesiones por puñaladas pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 y 21K15195 y una subvención interna de AIST, Japón.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
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