מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות
Summary
מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.
Abstract
בעוד שלדגי זברה יש יכולת מעולה לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS), למדאקה יש יכולת התחדשות CNS נמוכה יותר. מודל של פגיעה מוחית פותח בטקטום האופטי הבוגר של דגי זברה ומדאקה ובוצעו ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים השוואתיים כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה של רקמה זו על פני מיני דגים אלה. כאן מוצג מודל פגיעה בפצע דקירה עבור טקטום אופטי בוגר באמצעות מחט וניתוחים היסטולוגיים להתרבות והתמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs). מחט הוחדרה ידנית לאזור המרכזי של הטקטום האופטי, ואז הדגים היו מחוררים תוך לב, ומוחם נותח. רקמות אלה הוקפאו והוערכו באמצעות אימונוסטיין כנגד סמני ההתפשטות וההתמיינות המתאימים של NSC. מודל פגיעות טקטום זה מספק תוצאות חזקות וניתנות לשחזור הן בדגי זברה והן במדאקה, ומאפשר להשוות את תגובות המל”ל לאחר פציעה. שיטה זו זמינה לטלאוסטים קטנים, כולל דגי זברה, מדאקה וקיליפיש אפריקאי, ומאפשרת לנו להשוות את יכולת ההתחדשות שלהם ולחקור מנגנונים מולקולריים ייחודיים.
Introduction
לדגי זברה (Danio rerio) יש יכולת מוגברת לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) בהשוואה ליונקים אחרים 1,2,3. לאחרונה, כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס יכולת התחדשות מוגברת זו, בוצעו ניתוחים השוואתיים של התחדשות רקמות באמצעות טכנולוגיית ריצוף הדור הבא 4,5,6. מבני המוח בדגי זברה וטטרפודים שונים למדי 7,8,9. משמעות הדבר היא שמספר מודלים של פגיעות מוחיות המשתמשים בדגים קטנים עם מבני מוח דומים ומאפיינים ביולוגיים דומים פותחו כדי להקל על חקירת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים התורמים ליכולת התחדשות מוגברת זו.
בנוסף, מדאקה (Oryzias latipes) היא חיית מעבדה פופולרית עם יכולת נמוכה להתחדשות לב ועצב10,11,12,13 בהשוואה לדגי זברה. לדגי זברה ולמדקה יש מבני מוח ונישות דומים עבור תאי גזע עצביים בוגרים (NSCs)14,15,16,17. בדגי זברה ובמדאקה, הטקטום האופטי כולל שני סוגים של תאי גזע גזעיים דמויי נוירואפיתל ותאי גליה רדיאליים (RGCs)15,18. בעבר פותחה פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של דגי זברה בוגרים, ומודל זה שימש לחקר המנגנונים המולקולריים המווסתים את התחדשות המוח בבעלי חיים אלה 19,20,21,22,23. מודל פציעת פצע דקירה של דג זברה בוגר צעיר זה גרם לנוירוגנזה רגנרטיבית מ-RGCs 19,24,25. פציעת פצע דקירה זו בטקטום האופטי היא שיטה חזקה וניתנת לשחזור 13,19,20,21,22,23,24,25. כאשר אותו מודל פציעה יושם על מדאקה בוגרת, היכולת הנוירוגנית הנמוכה של RGCs בטקטום האופטי של מדאקה התגלתה באמצעות ניתוח השוואתי של התפשטות והתמיינות RGC לאחר פציעה13.
מודלים של פגיעות פצע דקירה בטקטום האופטי פותחו גם במודלים של מומיצ’וג26, אך פרטים על פגיעת הטקטום לא תועדו היטב בהשוואה לפגיעה טלנצפלית27. פציעת פצע הדקירה בטקטום האופטי באמצעות דגי זברה ומדאקה מאפשרת לחקור את התגובות התאיות הדיפרנציאליות ואת ביטוי הגנים בין מינים בעלי יכולת התחדשות דיפרנציאלית. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע פגיעה בפצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות מחט הזרקה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על דגים קטנים כמו דגי זברה ו medaka. התהליכים להכנת דגימות לניתוח היסטולוגי וניתוח התפשטות והתמיינות תאים באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית והקפאה מוסברים כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן מתוארת קבוצה של שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לגרום לפציעות פצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות מחט כדי להקל על הערכת התפשטות RGC והתמיינות לאחר פגיעה מוחית. פצעי דקירה בתיווך מחט הם שיטה פשוטה ויעילה המיושמת שניתן ליישם על דגימות ניסיוניות רבות באמצעות סט כלים סטנדרטי. מודלים של פגיעה בפצעי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI מענק מספר 18K14824 ו 21K15195 ומענק פנימי של AIST, יפן.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
