Модель колотой раны тектума зрительного нерва взрослого человека с использованием рыбок данио-рерио и медаки для сравнительного анализа регенеративной способности
Summary
Описана модель механической черепно-мозговой травмы у взрослых рыбок данио-рерио для исследования молекулярных механизмов, регулирующих их высокую регенеративную способность. Метод объясняет создание ножевого ранения в тектуме зрительного нерва нескольких видов мелких рыб для оценки регенеративных реакций с использованием флуоресцентного иммуноокрашивания.
Abstract
В то время как рыбки данио-рерио обладают превосходной способностью к регенерации своей центральной нервной системы (ЦНС), медака имеет более низкую регенеративную способность ЦНС. Модель черепно-мозговой травмы была разработана в тектуме зрительного нерва взрослых рыбок данио-рерио и медаки, и были проведены сравнительные гистологические и молекулярные анализы для выяснения молекулярных механизмов, регулирующих высокую регенеративную способность этой ткани у этих видов рыб. Здесь представлена модель ножевого ранения для тектума зрительного нерва взрослого человека с использованием иглы и гистологических анализов на пролиферацию и дифференцировку нейральных стволовых клеток (НСК). Иглу вручную вводили в центральную область тектума зрительного нерва, а затем рыб интракардиально перфузировали, а их мозг рассекали. Затем эти ткани были криосекций и оценены с использованием иммуноокрашивания по соответствующим маркерам пролиферации и дифференцировки НСК. Эта модель тектумной травмы обеспечивает надежные и воспроизводимые результаты как у рыбок данио, так и у медаки, что позволяет сравнивать реакции NSC после травмы. Этот метод доступен для небольших телеостов, включая рыбок данио, медаку и африканских рыб-убийц, и позволяет нам сравнивать их регенеративную способность и исследовать уникальные молекулярные механизмы.
Introduction
Рыбки данио-рерио (Danio rerio) обладают повышенной способностью к регенерации центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с другими млекопитающими 1,2,3. Недавно, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этой повышенной регенеративной способности, был проведен сравнительный анализ регенерации тканей с использованием технологии секвенирования следующего поколения 4,5,6. Структуры мозга у рыбок данио-рерио и четвероногих совершенно разные 7,8,9. Это означает, что было разработано несколько моделей черепно-мозговых травм с использованием мелких рыб со схожими структурами мозга и биологическими особенностями, чтобы облегчить исследование основных молекулярных механизмов, способствующих увеличению регенеративной способности.
Кроме того, медака (Oryzias latipes) является популярным лабораторным животным с низкой способностью к регенерации сердца и нейронов10,11,12,13 по сравнению с рыбками данио. Рыбки данио-рерио и медака имеют сходные структуры мозга и ниши для взрослых нейральных стволовых клеток (НСК)14,15,16,17. У рыбок данио-рерио и медаки тектум зрительного нерва включает два типа НСК: нейроэпителиоподобные стволовые клетки и радиальные глиальные клетки (RGCs)15,18. Ранее была разработана ножевая рана для тектума зрительного нерва взрослых рыбок данио, и эта модель была использована для исследования молекулярных механизмов, регулирующих регенерацию мозга у этих животных 19,20,21,22,23. Эта молодая взрослая модель ножевых ранений рыбок данио-рерио индуцировала регенеративный нейрогенез из RGC 19,24,25. Это ножевое ранение в тектуме зрительного нерва является надежным и воспроизводимым методом 13,19,20,21,22,23,24,25. Когда та же модель травмы была применена к взрослой медаке, низкая нейрогенная способность RGC в тектуме зрительного нерва medaka была выявлена с помощью сравнительного анализа пролиферации и дифференцировки RGC после травмы13.
Модели ножевых ранений в тектуме зрительного нерва также были разработаны в моделяхмумихога 26, но детали повреждения тектума не были хорошо задокументированы по сравнению с повреждением теленцефала27. Ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с использованием рыбок данио-рерио и медаки позволяет исследовать дифференциальные клеточные реакции и экспрессию генов между видами с дифференциальной регенеративной способностью. В этом протоколе описывается, как выполнить ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с помощью инъекционной иглы. Этот метод может быть применен к мелким рыбам, таким как рыбки данио-рерио и медака. Здесь объясняются процессы подготовки образцов для гистологического анализа и анализа клеточной пролиферации и дифференцировки с использованием флуоресцентной иммуногистохимии и криосекций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описан набор методов, которые могут быть использованы для индуцирования ножевых ранений в тектуме зрительного нерва с использованием иглы для облегчения оценки пролиферации и дифференциации RGC после черепно-мозговой травмы. Игольчатые ножевые ранения представляют собой просто…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом JSPS KAKENHI No 18K14824 и 21K15195 и внутренним грантом AIST, Япония.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
