Modèle de blessure par arme blanche du tectum optique adulte à l’aide de poisson-zèbre et de Medaka pour l’analyse comparative de la capacité de régénération
Summary
Un modèle de lésion cérébrale mécanique chez le poisson-zèbre adulte est décrit pour étudier les mécanismes moléculaires régulant leur capacité de régénération élevée. La méthode explique de créer une blessure par arme blanche dans le tectum optique de plusieurs espèces de petits poissons afin d’évaluer les réponses régénératives à l’aide d’immunomarquage fluorescent.
Abstract
Alors que le poisson zèbre a une capacité supérieure à régénérer son système nerveux central (SNC), le médaka a une capacité de régénération du SNC inférieure. Un modèle de lésion cérébrale a été développé dans le tectum optique adulte du poisson zèbre et du médaka et des analyses histologiques et moléculaires comparatives ont été effectuées pour élucider les mécanismes moléculaires régulant la capacité de régénération élevée de ce tissu chez ces espèces de poissons. Ici, un modèle de blessure par arme blanche est présenté pour le tectum optique adulte à l’aide d’une aiguille et d’analyses histologiques pour la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales (CSN). Une aiguille a été insérée manuellement dans la région centrale du tectum optique, puis les poissons ont été perfusés par voie intracardiale, et leur cerveau a été disséqué. Ces tissus ont ensuite été cryosectionnés et évalués à l’aide d’immunomarquage contre les marqueurs appropriés de prolifération et de différenciation des CSN. Ce modèle de lésion tectum fournit des résultats robustes et reproductibles chez le poisson-zèbre et le médaka, ce qui permet de comparer les réponses aux CSN après une blessure. Cette méthode est disponible pour les petits téléostéens, y compris le poisson zèbre, le médaka et le killifish africain, et nous permet de comparer leur capacité de régénération et d’étudier des mécanismes moléculaires uniques.
Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) a une capacité accrue à régénérer son système nerveux central (SNC) par rapport aux autres mammifères 1,2,3. Récemment, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette capacité de régénération accrue, des analyses comparatives de la régénération tissulaire à l’aide de la technologie de séquençage de nouvelle génération ont été effectuées 4,5,6. Les structures cérébrales du poisson zèbre et des tétrapodes sont très différentes 7,8,9. Cela signifie que plusieurs modèles de lésions cérébrales utilisant de petits poissons ayant des structures cérébrales et des caractéristiques biologiques similaires ont été développés pour faciliter l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents contribuant à cette capacité de régénération accrue.
En outre, le médaka (Oryzias latipes) est un animal de laboratoire populaire avec une faible capacité de régénération cardiaque et neuronale10,11,12,13 par rapport au poisson zèbre. Le poisson-zèbre et le medaka ont des structures cérébrales et des niches similaires pour les cellules souches neurales adultes (CSN)14,15,16,17. Chez le poisson-zèbre et le médaka, le tectum optique comprend deux types de CSN, les cellules souches de type neuroépithélial et les cellules gliales radiales (CGR)15,18. Une blessure par arme blanche pour le tectum optique du poisson-zèbre adulte a déjà été développée, et ce modèle a été utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires régulant la régénération cérébrale chez ces animaux 19,20,21,22,23. Ce modèle de blessure par arme blanche chez le poisson zèbre jeune adulte a induit une neurogenèse régénérative à partir des CGR 19,24,25. Cette blessure par arme blanche dans le tectum optique est une méthode robuste et reproductible 13,19,20,21,22,23,24,25. Lorsque le même modèle de blessure a été appliqué au médaka adulte, la faible capacité neurogène des CGR dans le tectum optique medaka a été révélée par l’analyse comparative de la prolifération et de la différenciation des CGR après une blessure13.
Des modèles de blessures par arme blanche dans le tectum optique ont également été développés dans les modèles de porc mummichog26, mais les détails de la lésion tectum n’ont pas été bien documentés par rapport aux lésions télencéphaliques27. La blessure par arme blanche dans le tectum optique à l’aide de poisson zèbre et de médaka permet d’étudier les réponses cellulaires différentielles et l’expression génique entre les espèces ayant une capacité de régénération différentielle. Ce protocole décrit comment effectuer une blessure par arme blanche dans le tectum optique à l’aide d’une aiguille d’injection. Cette méthode peut être appliquée aux petits poissons comme le poisson zèbre et le medaka. Les processus de préparation des échantillons pour l’analyse histologique et l’analyse de prolifération et de différenciation cellulaire à l’aide de l’immunohistochimie fluorescente et des cryosections sont expliqués ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, un ensemble de méthodes est décrit qui peut être utilisé pour induire des blessures par arme blanche dans le tectum optique en utilisant une aiguille pour faciliter l’évaluation de la prolifération et de la différenciation du RGC après une lésion cérébrale. Les coups de couteau médiés par aiguille sont une méthode simple et efficacement mise en œuvre qui peut être appliquée à de nombreux échantillons expérimentaux à l’aide d’un ensemble standard d’outils. Des modèles de blessures par ar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 et 21K15195 et une subvention interne de AIST, Japon.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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