نموذج إصابة جرح الطعنة للتكتوم البصري البالغ باستخدام الزرد و Medaka للتحليل المقارن للقدرة التجديدية
Summary
تم وصف نموذج إصابة الدماغ الميكانيكية في الزرد البالغ للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تنظم قدرتها العالية على التجدد. تشرح الطريقة إنشاء إصابة جرح طعنة في القفص البصري لأنواع متعددة من الأسماك الصغيرة لتقييم الاستجابات التجديدية باستخدام التلوين المناعي الفلوري.
Abstract
في حين أن الزرد لديه قدرة فائقة على تجديد الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، فإن medaka لديه قدرة أقل على تجديد الجهاز العصبي المركزي. تم تطوير نموذج إصابة الدماغ في القفص البصري البالغ لسمك الزرد والميداكا وتم إجراء تحليلات نسيجية وجزيئية مقارنة لتوضيح الآليات الجزيئية التي تنظم القدرة التجديدية العالية لهذا النسيج عبر هذه الأنواع من الأسماك. هنا يتم تقديم نموذج إصابة جرح الطعنة للصمت البصري البالغ باستخدام إبرة وتحليلات نسيجية لتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية العصبية (NSCs). تم إدخال إبرة يدويا في المنطقة الوسطى من القفص البصري ، ثم تم ترشيح الأسماك داخل القلب ، وتم تشريح أدمغتها. ثم تم تشريح هذه الأنسجة بالتبريد وتقييمها باستخدام تلطيخ مناعي ضد علامات انتشار وتمايز NSC المناسبة. يوفر نموذج إصابة القفص هذا نتائج قوية وقابلة للتكرار في كل من الزرد والميداكا ، مما يسمح بمقارنة استجابات NSC بعد الإصابة. هذه الطريقة متاحة للأسماك الصغيرة ، بما في ذلك الزرد ، والميداكا ، وسمك الكيلي الأفريقي ، وتمكننا من مقارنة قدرتها على التجدد والتحقيق في الآليات الجزيئية الفريدة.
Introduction
الزرد (Danio rerio) لديها قدرة متزايدة على تجديد الجهاز العصبي المركزي (CNS) مقارنة بالثديياتالأخرى 1،2،3. في الآونة الأخيرة ، لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه القدرة التجديدية المتزايدة بشكل أفضل ، تم إجراء تحليلات مقارنة لتجديد الأنسجة باستخدام تقنية تسلسل الجيل التالي4،5،6. تختلف هياكل الدماغ في الزرد ورباعيات الأرجل تماما7،8،9. وهذا يعني أنه تم تطوير العديد من نماذج إصابات الدماغ باستخدام أسماك صغيرة ذات هياكل دماغية وخصائص بيولوجية مماثلة لتسهيل التحقيق في الآليات الجزيئية الأساسية التي تساهم في هذه القدرة التجديدية المتزايدة.
بالإضافة إلى ذلك ، medaka (Oryzias latipes) هو مختبر شهير ذو قدرة منخفضة على تجديد القلب والخلايا العصبية10،11،12،13 مقارنة بسمك الزرد. يمتلك الزرد والميداكا هياكل دماغية ومنافذ مماثلة للخلايا الجذعية العصبية البالغة (NSCs)14،15،16،17. في الزرد والميداكا ، يشتمل القفص البصري على نوعين من NSCs ، الخلايا الجذعية الشبيهة بالظهارة العصبية والخلايا الدبقية الشعاعية (RGCs)15,18. تم تطوير إصابة جرح طعنة للقفص البصري لسمك الزرد البالغ سابقا ، وتم استخدام هذا النموذج للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تنظم تجديد الدماغ في هذه الحيوانات19،20،21،22،23. هذا النموذج إصابة طعنة الزرد الشباب البالغين الناجم عن تكوين الخلايا العصبية التجديدية من RGCs19،24،25. إصابة جرح الطعنة هذه في القفص البصري هي طريقة قوية وقابلة للتكرار 13،19،20،21،22،23،24،25. عندما تم تطبيق نفس نموذج الإصابة على medaka للبالغين ، تم الكشف عن القدرة العصبية المنخفضة ل RGCs في medaka optic tectum من خلال التحليل المقارن لانتشار RGC والتمايز بعد الإصابة13.
كما تم تطوير نماذج إصابة جرح الطعنات في القفص البصري في نماذج المومياوات26 ، ولكن لم يتم توثيق تفاصيل إصابة القفص جيدا عند مقارنتها بإصابة الدماغ27. تسمح إصابة جرح الطعنة في القفص البصري باستخدام الزرد والميداكا بالتحقيق في الاستجابات الخلوية التفاضلية والتعبير الجيني بين الأنواع ذات القدرة التفاضلية على التجدد. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء إصابة جرح طعنة في القفص البصري باستخدام إبرة الحقن. يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأسماك الصغيرة مثل الزرد و medaka. يتم شرح عمليات تحضير العينات للتحليل النسيجي والانتشار الخلوي وتحليل التمايز باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية والأقسام المبردة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يتم وصف مجموعة من الطرق التي يمكن استخدامها للحث على إصابات جرح الطعنات في القفص البصري باستخدام إبرة لتسهيل تقييم انتشار RGC والتمايز بعد إصابة الدماغ. جروح الطعنات بوساطة الإبرة هي طريقة بسيطة وفعالة يمكن تطبيقها على العديد من العينات التجريبية باستخدام مجموعة قياسية من الأدوات. تم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 18K14824 و 21K15195 ومنحة داخلية من AIST ، اليابان.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
